OCENA ZAWARTOŚCI LH I FSH W TKANCE GRUCZOLAKA STERCZA
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1988/41/1.

Gruczolak stercza jest chorobą powszechnie spotykaną u starzeją­cych się mężczyzn. Około 65,0% populacji powyżej 60 roku życia ma kliniczne objawy gruczolaka stercza (6, 18). W badaniach pośmiertnych stwierdza się gruczolak stercza u około 75,O°/o mężczyzn powyżej 70 roku życia (9, 18).

Etiopatogeneza gruczolaka stercza nie jest całkowicie poznana. Ba­dania Hugginsa (10, 11) wskazały na istotną rolę czynników hormonal-nych w rozwoju gruczolaka i raka stercza. U mężczyzn powyżej 60 roku życia, w wyniku zmian zanikowych w komórkach Leydiga jąder, dochodzi do obniżenia we krwi stężeń testosteronu, dwuhydrotestostero-nu (15) i androstandiolu (8). Obniżenie stężenia aktywnych androgenów prowadzi na drodze ujemnego sprzężenia zwrotnego do wzrostu wy­dzielania gonadotropin LH i FSH (12). Podwyższone stężenie testoste­ronu (1), dwuhydrotestosteronu (7) w surowicy krwi i zwiększenie ak­tywności enzymów, biorących udział w przemianach androgenów w gru­czole krokowym (1, 13), wskazuje na zwiększony metabolizm androge­nów u chorych z łagodnym rozrostem gruczołu krokowego.

Wysunięto hipotezę, że w gruczole krokowym może odbywać się nie tylko metabolizm, lecz także produkcja androgenów, która jest stymu­lowana przez gonadotropiny (2). Potwierdzeniem tej hipotezy było by stwierdzenie receptorów gonadotropinowych lub obecności gonadotropin w tkance gruczołu krokowego. Dotychczas wykazano w gruczole kro­kowym obecność receptorów dla androgenów, estrogenów, progesteronu (5) oraz prolaktyny (14).

Możliwość znacznego stopnia wysycenia receptorów dla LH i FSH przez endogenne LH i FSH, jak również heterogenność gruczołu kro­kowego bogatego w tkankę łączną i mięśniową, które mogą wpływać na wielkość wiązania niespecyficznego i stężenia receptorów w tkance gruczołu krokowego, stanowią istotne trudności w badaniach nad obec­nością receptorów błonowych dla gonadotropin. Badania należało zatem ukierunkować na ilościowe pomiary LH i FSH w tkance gruczołu kro­kowego.

Celem pracy było wykazanie obecności gonadotropin w tkance gru­czolaka stercza.

MATERIAŁ I METODYKA

Material stanowiło 46 tkanek gruczolaka stercza, 12 tkanek jąder, 10 tkanek mięśni szkieletowych. Tkanki gruczolaka stercza uzyskiwano pod­czas nadłonowej, przezpęcherzowej adenomektomii. Wiek chorych wa­hał się od 58 do 82 lat (x = 67,7 lat). Rozpoznanie kliniczne zweryfiko­wano u każdego chorego badaniem histologicznym. Tkanki jąder uzys­kiwano podczas operacji usunięcia jądra wykonywanych ze wskazań urologicznych (zapalenie jądra i najądrza). Wiek chorych wahał się w granicach 41 do 81 lat (x = 65,5 lat). Rozpoznanie kliniczne potwierdza­no badaniem histologicznym. Tkanki mięśni szkieletowych uzyskiwano podczas operacji ortopedycznych. Wiek chorych wahał się w granicach od 23 do 57 lat (x = 42,2 lat). Badania histologiczne wykonywał Zakład Anatomii Patologicznej (Kierownik: prof. dr hab. med. S. Kruś). Po­bierano również próbki krwi obwodowej chorych w objętości 2 ml na ok. 3 godziny przed operacją.

Tkanki umieszczano bezpośrednio po ich pobraniu w suchym lodzie i przechowywano w temperaturze ?20°C do chwili wykonania ozna­czeń. Krew pobierano do plastykowych probówek. Po wytworzeniu skrzepu wirowano probówki w temperaturze 4°C przez 5 minut z pręd­kością 1400 XG. Surowicę natychmiast oddzielano, zamrażano i prze­chowywano do chwili oznaczeń w temperaturze ?20°C. Chorych nie leczono poprzednio preparatami hormonalnymi.

METODA

Zastosowano metodę ekstrakcji LH i FSH z osadów tkankowych i ich radioimmunologicznego oznaczania opierając się na pracach Diek-mana (4) i Zięcika (20). Tkanki, po ich rozmrożeniu, krojono na drobne skrawki i homogenizowano w buforze fosforanowym o pH-7,5 w pro-porcji 3 ml buforu na 1 g tkanki używając homogenizatora Ultra Tur-rax. Tkanki homogenizowano trzykrotnie po 5 sek stosując 30 s przerwy na chłodzenie. Homogenat tkankowy wirowano przy 100 000 XG przez 30 minut w temperaturze 4°C uzyskując osad tkankowy i cytozol. Osad ekstrahowano 0,lN kwasem mrówkowym w proporcji 5 ml kwasu na 1 g osadu przez 16 godzin w temperaturze 4°C, a następnie całość wiro­wano przy 4000 XG przez 30 minut w temperaturze 4°C. Otrzymany supernatant liofilizowano. Rozmrażanie tkanki i wszystkie etapy postę­powania do momentu liofilizacji. przeprowadzano w temperaturze 4°C. W liofilizatach i cytozolach tkankowych oznaczano metodami radioim-munologicznymi LH i FSH. Schemat metodyki przedstawiono na ryc. 1.

Stężenie LH i FSH w tkankach obliczano, dodając LH i FSH uzys­kane z liofilizatu i cytozolu i wyrażano w mU LH i mU FSH w przeli­czeniu na 1 g tkanki.

Stężenie LH i FSH w surowicy krwi chorych wyrażano w mU LH i mU FSH w przeliczeniu na 1 ml surowicy. LH i FSH w surowicy krwi, cytozolach i liofilizatach z ekstraktów osadów tkankowych ozna­czano metodą radioimmunologiczną podwójnych przeciwciał według Mid-gleya (16, 17). Pierwsze przeciwciała stanowiła surowica królicza prze-ciw ludzkiej lutropinie (surowica anty-LH, Biomed, Polska), i surowica, królicza przeciw ludzkiej folitropinie (surowica anty-FSH, Biomed, Pols­ka). Rozcieńczenie końcowe surowicy anty-LH wynosiło 1 : 750 000, su­rowica anty-LH wykazywała aktywność krzyżową z FSH 8,0% i z TSH 13,0%. Rozcieńczenie końcowe surowicy anty-FSH wynosiło 1 : 50 000, surowica anty-FSH wykazywała reaktywność krzyżową z LH 3,6% i z TSH 7,0%.

Drugie przeciwciało stanowiła immunoglobulina barania precypitu-jąća surowicę króliczą (Biomed, Polska). Do jodowania używano ludzkich preparatów LH i FSH, które otrzymano od dr P. J. Lowery ze Szpi­tala Św. Bartłomieja w Londynie, LH i FSH jodowano przy użyciu jodogenu (IODO-GEN?, Pierce, USA).

Stosowano standard LH. 68/40 i FSH 78/549 otrzymane z National Institute for Biological Standards and Control (Londyn).

Czułość metody radioimmunologicznego oznaczania LH wynosiła 1,5 mU/ml a FSH 0,8 mU/ml.

W metodach radioimmunologicznego oznaczania LH i FSH błąd we-wnątrzseryjny wynosił 6,5%, błąd międzyseryjny 12,0%.

Celem określenia wpływu 0,1N kwasu mrówkowego na immunore-aktywność LH i FSH wykonywano krzywe wzorcowe dla LH i FSH ze standardami ekstrahowanymi i nieekstrahowanymi 0,1 kwasem mrów­kowym (ryc. 2 i ryc. 3).

Ze względu na to, że 0,1N kwas mrówkowy mógł mieć wpływ na przebieg krzywych wzorcowych, wartość LH i FSH oznaczane w liofili­zatach odczytywano z krzywych wzorcowych standardów ekstrahowa-nych 0,1N kwasem mrówkowym.

Odzysk LH i FSH z osadu tkankowego określano, dodając znane ilości standardów LH i FSH do osadu tkankowego (1,5?400 mU/g osa­du tkankowego), które następnie poddawano dalszej procedurze ekstrak­cji i liofilizacji przedstawionej na ryc. 1.

Odzysk LH z osadu tkankowego wynosił od 89,0% do 107,0% (x= =97%), a FSH od 87,0% do 108,0% (x = 105%).

Wartości LH i FSH oznaczane w liofilizacie były proporcjonalne do stężenia liofilizatu. Krzywe zależności pomiędzy stężeniem liofilizatu, a oznaczanymi wartościami LH i FSH wykazywały liniowy charakter.

WYNIKI

W tabeli I podano ilości LH i FSH uzyskane z osadów tkankowych i cytozolu w przeliczeniu na 1 g tkanki dla gruczolaka stercza i jądra. Ilości LH i FSH uzyskane z osadów tkankowych były wyższe od ilości LH i FSH uzyskanych z cytozoli dla gruczolaka stercza i jądra. Róż­nice pomiędzy odpowiednimi średnimi arytmetycznymi były statystycz­nie znamienne (p<0,001).

Wyniki badań, przedstawiające zawartość LH i FSH w tkance gru­czolaka stercza i jądra, a także stężenie LH i FSH w surowicy chorych przedstawiono w tabeli II i III oraz na ryc. 4 i 5.

Nie stwierdzono mierzalnych ilości LH i FSH w tkance ludzkiego mięśnia szkieletowego użytej jako tkanka kontrolna.

Stężenie LH w tkance gruczolaka stercza było zbliżone do stężenia LH w tkance jądra. Różnica pomiędzy odpowiednimi średnimi arytme­tycznymi była statystycznie nieznamienna (p>0,05).

Stężenie LH w tkance gruczolaka stercza w przeliczeniu na 1 g tkanki było wyższe niż stężenie LH w surowicy krwi chorych w przeli­czeniu na 1 ml surowicy. Różnica pomiędzy odpowiednimi średnimi arytmetycznymi była statystycznie znamienna (p<0,001). Stężenie LH w tkance jądra w przeliczeniu na 1 g tkanki było wyższe niż stężenie LH w surowicy chorych w przeliczeniu na 1 ml surowicy. Różnica po­między odpowiednimi średnimi arytmetycznymi była statystycznie zna­mienna (p<0,001).

Stosunek stężenia LH w tkance do stężenia LH w surowicy był wyższy dla tkanki jądra niż dla tkanki gruczolaka stercza. Różnica po­między odpowiednimi średnimi arytmetycznymi była statystycznie zna­mienna (p<0,001).

Stężenie FSH w tkance gruczolaka stercza było niższe niż stężenie FSH w tkance jądra. Różnica pomiędzy odpowiednimi średnimi arytme­tycznymi była statystycznie znamienna (p<0,001). Stężenie FSH w tkance gruczolaka stercza w przeliczeniu na 1 g tkanki było wyższe niż stężenie FSH w surowicy krwi chorych w przeliczeniu na 1 ml surowicy. Różnica pomiędzy odpowiednimi średnimi arytmetycznymi była statystycznie znamienna (p<0,001). Stężenie FSH w tkance jądra w przeliczeniu na 1 g tkanki było wyższe niż stężenie FSH w surowicy krwi chorych w przeliczeniu na 1 ml surowicy. Różnica pomiędzy od­

powiednimi średnimi arytmetycznymi była statystycznie znamienna (p< <0,001). Stosunek stężenia FSH w tkance do stężenia FSH w suro­ wicy krwi był wyższy dla tkanki jądra niż dla tkanki gruczolaka ster­ cza. Różnica pomiędzy odpowiednimi średnimi arytmetycznymi była sta­ tystycznie znamienna (p<0,001).

OMÓWIENIE

Belis (3) opisał technikę ekstrakcji i radioimmunologicznego ozna­czania endogennych hormonów sterydowych w tkance ludzkiego gru­czołu krokowego. Diekman (4) i Zięcik (20) zastosowali metodę ekstrak­cji i radioimmunologicznego oznaczania endogennego LH w tkance ciała żółtego u zwierząt przy zastosowaniu 0,1N kwasu mrówkowego jako eluanta. Posługując się metodą ekstrakcji gonadotropin z osadów tkan­kowych przy użyciu 0,1N kwasu mrówkowego i ich radioimmunolo­gicznym oznaczaniem wykazano obecność LH i FSH w tkance gruczołu krokowego w stężeniach znacznie przekraczających ich stężenia w su­rowicy krwi. Stwierdzoną przez nas nieznaczną zawartość LH i FSH w cytozolu tkankowym można tłumaczyć niewielkiego stopnia dysocja-cją kompleksu gonadotropin ? receptor błonowy i uwalnianiem gona­dotropin do cytozolu tkankowego. Gonadotropiny LH i FSH wpływają na syntezę i przemianę androgenów w jądrze. Uzyskane wyniki badań wskazują na obecność LH i FSH w tkance gruczolaka stercza w stęże­niach znacznie przekraczających stężenia LH i FSH w surowicy krwi. Należy więc przypuszczać, że gonadotropiny LH i FSH mogą wpływać na metabolizm, a być może i na produkcję androgenów przez gruczoł krokowy. Możliwość uzyskania znacznego obniżenia poziomu androge­nów w surowicy krwi przez podawanie analogów LH-RH było przyczy­ną podjęciu próby leczenia raka gruczołu krokowego analogami LH-RH (19). Wykazanie obecności LH i FSH w tkance gruczołu krokowego w stężeniach przekraczających wartości stwierdzane w surowicy krwi może wskazywać na istnienie w gruczole krokowym mechanizmów regulują­cych metabolizm androgenów z udziałem LH i FSH. Obniżenie poziomu LH i FSH pod wpływem przewlekłego podawania aktywnych analogów LH-RH mogłoby w sposób bezpośredni wpływać na czynność gruczołu krokowego. Wyniki badań mogą stanowić patofizjologiczne uzasadnienie dla empirycznego stosowania leków blokujących wydzielanie gonadotro­pin u chorych na gruczolak i raka stercza. Stwierdzenie obecności go­nadotropin w tkance gruczołu krokowego pozwala ponadto na wysunię­cie sugestii o możliwości istnienia receptorów gonadotropinowych w tkance gruczołu krokowego.

WNIOSKI

1.Wykazano obecność gonadotropin LH i FSH w tkance gruczolaka stercza.

2.Stężenia LH i FSH w tkance gruczolaka stercza przekraczały ich stężenia w surowicy krwi.

3.Stężenie LH w tkance gruczolaka stercza nie różniło się istotnie od stężenia w tkance jądra.

4.Wykazanie obecności LH i FSH w tkance gruczolaka stercza w stężeniach przekraczających wartości stwierdzane w surowicy krwi może wskazywać na istnienie w gruczolaku stercza mechanizmów regu­ lujących metabolizm androgenów z udziałem LH i FSH.

Autorzy wyrażają podziękowanie mgr H. Snochowskiej, E. Malickiej i M. Wit-kowskiemii za udział w pracach laboratoryjnych oraz dr M. Snochowskiemu za cen­ną pomoc w czasie wykonywania badań.

1. 1. Baranowska B., Zgliczyński S.: Prostatectomy-induced decrease in an en­
2. hanced serum testosterone concentration in patients with prostatic hyperplasia and
3. its pathophysiological imiplications. Endocr. Pol., 1979, XXX, 75. ? 2. Baranows­
4. ka B., Zgliczyński S., Szymanowski J.: Les troubles de bilan hormonal chez les
5. hommes porteurs d'un adenome prostatique. J. d'Urol., 1980, 86, 851. ? 3. Belis J. A.:
6. Methodologic basis for the radioimmunoassay of endogenous steroids in human
7. prostatic tissue. Investe. Urol.. 1980, 17, 332. ? 4. Diekman M. A., O'Callaghan P.,
8. Nett T. M., Niswender G. D.: Validation of methods and quantification of luteal re­
9. ceptors for LH throughout the estrous cycle and early pregnancy in ewes. Biol.
10. Reprod., 1978, 18, 999. ? 5. Ekman P., Snochowski M., Dahlberg E., Bression D.,
11. Hogberg B., Gustafsson J. A.: Androgen, progestin and estrogen receptors content
12. in normal and hyperplastic human prostate. J. Clin. Endocr. Metab., 1979, 49, 205. ?
13. 6. Flocks R. M.: Benign prostatic hypertrophy: its diagnosis and menagement. Med.
14. Times N. Y., 1964, 92, 519. ? 7. Ghanadian R., Lewis J.G., Chisholm G.D., O Do-
15. noghue E. P. N.: Serum dihydrotestosterone in patients with benign prostatic hy-
16. perthrophy. Br. J. Urol., 1977, 49, 541. ? 8. Ghanadian R, Puah C.M.: Relationships
17. between oestradiol-17B), testosterone, dihydrotestosterone and 5a-androstane-3a, 17|3-
18. -dill in human benign hypertrophy ans carcinoma of the prostata. J.Endocr., 1981,
19. 88, 255. ? 9. Harbitz T. B., Haugen O. A.: Histology of the prostate in elderly men.
20. Acta path. microbial. scand. (A), 1972, 80, 756. ? 10. Huggins C: The etiology of
21. benign prostatic hypertrophy. Bull N. Y. Acad. Med., 1947, 23, 696.
22. 11. Huggins C, Hodges CV.: Studies on prostatic cancer. I. The effect of cas­
23. tration, of estrogen and of androgen injection on serum phosphatase in metastatic
24. carcinoma of the prostate. Cancer Res. 1941, 1, 293. ? 12. Isurugi K.F., Fukutani K.,
25. Takayasu H. I., Nakabayashi K., Tamaoki B. I.: Age related changes in serum lu­
26. teinizing hormone (LH) and follicle stimulating hormone (FSH) levels in normal
27. men. J. clin. Endocr. Metab., 1974, 39, 955. ? 13. Krieg M., Bartsch W., Voigt K.D.:
28. Binding metabolism and tissue levels of androgens in human prostatic carcinoma,
29. benign prostate hyperplasia and normal prostate. Steroid Receptors. Metabolism and
30. prostatic cancer. Schroder F. H. and de Voogt H. J. (eds), 1980, XX, 102, (Amster­
31. dam: Excerpta Medica). ? 14. Leake A., Chisholm G. D., Habib F. K.: Characteri­
32. zation of the prolactin receptor in human prostate. J. Endocr., 1983, 99, 321. ?
33. 15. Lewis J. D., Ghanadian R., Chisholm G. D.: Serum 5a-dihydrotestosterone and
34. testosterone changes with age in man. Acta endocr., 1976, 82, 444. ? 16. Midgley
35. A. R.: Radioimmunoassay: a method for human chorionic gonadotropin and hu­
36. man luteinizing hormone. Endocrinology, 1976, 79, 10. ? 17. Midgley A. R.: Radio­
37. immunoassay for human follicle-stimulating hormone. J. clin. endocr. Metab., 1977,
38. 27, 295. ? 18. Moore R. A.: Benign hypertrophy of the prostate. A morphological
39. study. J. Urol., 1943, 50, 580. ? 19. Yamanaka H., Makino T., Yajima H., Saruki K.,
40. Shida K.: Efficacy of (D-LEU)-DES GLY-NH10-LH-RH ethylamide against prosta­
41. tic. Prostate, 1985, 6, 27. ? 20. Zięcik A., Shaw H.J., Flint A.P.E.: Luteal LH
42. receptors during the oestrus cycle and early pregnancy in the pig. J. Reprod. Fert.,
43. 1980, 60, 129.