PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

PORÓWNANIE AKTYWNOŚCI CYTOTOKSYCZNEJ LIMFOCYTÓW NACIEKAJĄCYCH GUZ NERKI - TIL, STYMULOWANYCH IL-2 ORAZ BCG
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1997/50/2.

autorzy

Stanisław Wroński
Katedra i Zakład Patomorfologii Klinicznej AM w Bydgoszczy
Kierownik Zakładu: prof. zw. dr hab. n. med. J. Domaniewski
Oddział Urologii Szpitala Wojewódzkiego im. dr J. Bizieła w Bydgoszczy
Ordynator Oddziału: dr n. med. Z. Jarzemski

słowa kluczowe

nerka rak nerki aktywność cytotoksycznych limfocytów

streszczenie

Cel pracy. Immunoterapia adaptacyjna jest nową metodą leczenia zaawan-
sowanych nowotworów. Polega na przeniesieniu do organizmu chorego ho-
dowanych in vitro namnożonych limfocytów cytotoksycznych naciekających
guz (TIL). Autorzy porównali skuteczność stymulacji limfocytów T cytotok-
sycznych przez interleukinę 2 (IL-2) i BCG.
Materiał i metoda. Materiał do hodowli limfocytów pobierano z guzów nerek
8 chorych, poddanych nefrektomii z powodu raka jasnokomórkowego. Fe-
notyp komórek hodowli oznaczano przeciwciałami anty-CD3 i CD8. Do jed-
nej części hodowli dodawano WOO U/ml IL-2, a do drugiej po 500 U/ml IL-2
oraz 0,5 mg BCG (7000000 komórek/mg). Aktywność komórek TIL ocenia-
no na podstawie ich działania na komórki autologicznego guza.
Wyniki. Obserwowano podobną liczbę komórek w 10 g próbki guza jak rów-
nież zbliżoną liczbę limfocytów cytotoksycznych naciekających guz. Limfo-
cyty naciekające guz hodowane w środowisku IL-2 i dodatkowo stymulowa-
ne antygenem, wykazują wyższą aktywność cytotoksyczną od komórek ho-
dowanych tylko z IL-2.
Wnioski. Stymulacja limfocytów naciekających guz przez BCG pozwala ogra-
niczyć stosowanie interleukiny 2 (IL-2), a aktywnośść stymulowanych komó-
rek jest wysoka.

Pomimo znacznego postępu w leczeniu nowotworów, rak nerkowokomórko-

wy (RCC – renal cell cancer) nadal stanowi istotny problem terapeutyczny. RCC cechuje się znaczną skłonnością do tworzenia przerzutów [3]. Dane statystyczne oparte na dużym materiale wykazują że przerzuty istniejąu około 25% pacjentów w trakcie pierwszego kontaktu z lekarzem. Po leczeniu, którego podstawą, w chwili obecnej jest nefrektomia radykalna, przerzuty wystąpią u 30%-50% pacjentów uważanych za wyleczonych, wciągu 2 lat po zabiegu [2].


Jednocześnie zagadnienie komplikuje oporność komórek raka nerkowokomór- kowego na stosowane obecnie cytostatyki oraz radioterapię. Chemioterapia oraz Rtg-terapia wykazują skuteczność u około 10% pacjentów, u których stwierdzo- no przerzuty, a średni okres ich przeżycia nie przekracza 18 miesięcy [1,5]. Po- dobnie brak skuteczności wykazuje szeroko stosowana do niedawna hormonote- rapia [3]. Istniejądane, iż zjawisko to związane może być z obecnością błonowej glikoproteiny P, odpowiedzialnej za ?wypompowywanie” m.in. cytostatyków z komórki. Nerka jest jednym z narządów, których komórki są szczególnie bogate w ten błonowy transporter [6]. Dlatego też, wielu badaczy zwróciło się ku nowo- powstałym metodom terapii nowotworów. Postępy cytofizjologii oraz biologii molekularnej pozwoliły, na przynajmniej częściowe, zrozumienie procesów od- pornościowych zachodzących w organizmie chorego na raka pacjenta. Szczegól- nie prace dotyczą możliwości wykorzystania hodowanych in vitro limfocytów do leczenia zaawansowanego raka nerki ? immunoterapii adaptacyjnej. Obecnie istnieje kilka metod takiego leczenia zależnie od typu wykorzystanych komórek, miejsca ich pobrania oraz sposobu stymulacji i hodowli. Badania te zainicjowane i prowadzone są przez S. Rosenberga od wczesnych lat osiemdziesiątych [7].


Jedna z najbardziej obiecujących metod polega na uzyskaniu z masy guza nacie- kających go limfocytów, ich hodowli ?in vitro” i po uzyskaniu odpowiedniej ilości i poddaniu dodatkowej stymulacji, przetoczeniu do organizmu chorego pacjenta. Niestety, metoda ta ze względu na wysokie koszty cytokin używanych do pod- trzymania limfocytów T w hodowli zastosowana została tylko u kilkudziesięciu pacjentów, przy czym uzyskano poprawę stanu zdrowia (wyrażonąjako przynaj- mniej częściową regresję guza) u ok. 30% pacjentów.


Kluczowym elementem hodowli jest jedna z cytokin – interleukiną 2 (IL-2). Jest to glikoproteina będąca najważniejszym czynnikiem podtrzymującym limfo- cyty T cytotoksyczne w hodowli. Zarazem jest ona najdroższym elementem im- munoterapii adaptacyjnej. Celowym wydaje się prowadzenie badań mających na celu optymalizację wa- runków hodowli, aby do podtrzymania cytotoksyczności komórek TIL i ich stałe- go namnażania wystarczały jak najmniejsze ilości IL-2.


MATERIAŁ I METODA


Poszukując źródeł stymulacji w prezentowanych badaniach sięgnąłem po anty- geny dobrze znane wszystkim urologom, a będące podstawą najpopularniejszej metody immunoterapii nowotworów, szczególnie czerniaka oraz raka przejściowo- komórko-wego pęcherza moczowego. Mowa o liofilizowanych komórkach BCG.


Materiał do hodowli pobierano z guzów nerek operowanych w Oddziale Uro- logii Szpitala Wojewódzkiego w Bydgoszczy. Użyto komórek pobranych z 8 gu- zów nerek w których badaniem histopatologicznym stwierdzono raka jasnoko- mórkowego.


Z każdego guza pobierano fragment guza o masie 10 g. Po oczyszczeniu z tkanki tłuszczowej i elementów łącznotkankowych preparat rozdrabniano me- chanicznie a następnie trawiono w 0,25% roztworze trypsyny przez około 50 min. Uzyskana masa, po inaktywacji enzymów, podlegała filtracji przez siatkę nylono- wą. Z mieszaniny komórkowej, oddzielano limfocyty wirując w gradiencie gęsto- ści Ficoll uropolina.


Uzyskane komórki zawieszano w zawiesinie w typowej gęstości 500.000 ko- mórek/ml. Fenotyp uzyskanych komórek oznaczany był przy pomocy przeciw- ciał anty-CD3 i CD8 znakowanych fluoresceiną. Od 4 dnia do hodowli dodawa- łem po 1000 U/ml IL-2 a do drugiej części każdej hodowli po 500 U/ml IL-2 oraz po 0,5 mg szczepu BCG Instytutu Pasteura o gęstości 7000000 komórek na mg liofilizatu.


IL-2 dostarczona została do hodowli komórek TIL dzięki uprzejmości firmy Roussel – UCLAF. Badania przeprowadzone zostały z komórkami 8 hodowli, gdzie udało się uzyskać żywotność komórek po 7 dniowej inkubacji. Do oceny aktywności litycznej komórek TIL użyto autologicznych komórek no- wotworowych przechowywanych w płynnym azocie. Po 40 minutowej inkubacji komórek nowotworowych z limfocytami T hodowanymi z II?2 oraz IL- 2 i BCG. Ocena żywotności komórek nowotworowych polegała na ocenie wybarwiania przy pomocy błękitu metylenowego – barwnika barwiącego martwe komórki.


WYNIKI


Uzyskane wyniki przedstawia poniższa tabela. Ilość komórek uzyskanych z 10 g tkanki każdego guza jest zbliżona w każdej próbce, co więcej odsetek uzyskiwanych komórek o fenotypie limfocytów cyto- toksycznych jest w każdym przypadku podobny. Wielkość lizy autologicznych komórek nowotworowych w obecności komórek TIL zależnie od rodzaju stymulacji przedstawiono w tabeli I.


DYSKUSJA


Wstępna analiza zależności pomiędzy stopniem G a aktywnością lityczną ko- mórek TIL hodowanych w obecności tylko IL-2 oraz z dodatkiem BCG wykaza- ła iż większy odsetek aktywności w hodowli tylko z IL-2 przypada na limfocyty cytotoksyczne pobrane z guzów mniej zróżnicowanych czyli potencjalnie bar- dziej złośliwych. Natomiast wzrost aktywności po hodowli z IL-2 i BCG jest większy w populacji limfocytów cytotoksycznych pobranych z guzów bardziej zróżnicowanych.


Być może ta wstępna i wymagająca dokładniejszego potwierdzenia obserwa- cja wskazuje iż limfocyty są silniej stymulowane przez komórki bardziej anapla- styczne co wiązać mogłoby się z ich większym ?odbiegnięciem” od wzorca anty- genowego prawidłowych komórek gospodarza. Wyższy wzrost aktywności po stymulacji IL-2 i BCG wśród limfocytów pobranych z guzów mniej zróżnicowa- nych sugerować może – moim zdaniem – iż limfocyty cytotoksyczne w obecności komórek bardziej anaplastycznych poprzez wspomniane poprzednio silniejsze pobudzenie wykorzystują większą część zdolności litycznych niż komórki z gu- zów wyżej zróżnicowanych.


WNIOSKI


1. Limfocyty naciekające guz hodowane w środowisku z IL-2 i dodatkowo stymulowane antygenem wykazują wyższą aktywność cytotoksyczną od komó- rek hodowanych tylko z IL-2.


2.Ilość limfocytów cytotoksycznych naciekających guz waha się w wąskich granicach


3.Odsetek komórek CD3+CD8+ w populacji komórek limfoidalnych guza nerki waha się w wąskich granicach.


4.Aktywność lityczna komórek TIL jest większa w populacjach uzyskanych z guzów bardziej anaplastycznych.


5.Wzrost aktywności litycznej po dodatkowej stymulacji antygenowej jest większa w populacjach uzyskanych z guzów wyżej zróżnicowanych.

piśmiennictwo

  1. [1] Boring, C. C.,Squires, T. S., Tong, T: Cancer Statistics 1992. CA Cancer, J. Clin.,
  2. 1992,42,19.
  3. [2] Cameron, R. B., Spiess, P. ]., Rosenberg, S. A.: Synergistic antitumor activity of
  4. tumor infiltrating lymphocytes, interleukin-2 and local tumor irradiation: studies
  5. on the mechanism of action. J. Exp. Med., 1990,171, 249.
  6. [3] Dybał, E. ]., Haas, P. G., Maughan, R. L., et al.: Synergy of radiation therapy and
  7. immunotherapy in murine renal cell carcinoma. J. Urol., 1992,148,1331.
  8. [4] Harris, D. T.: Hormonal therapy and chemotherapy of renal cell carcinoma. Semin.
  9. Oncol., 1983,10, 422.
  10. [5] Sondel, P. M., Kohler, P. C, Hank, J. A., et al.: Recombinant 11-2 given by
  11. repetitwe weekly cycles to patients with cancer: clinical and immunologic effects.
  12. Cancer Res., 1988, 48, 2561.
  13. [6] Siegsmund, M. }., Cardarelli, C, Aksentijevich, L, et al.: Ketoconazole effec-
  14. twel reverses multidrug resistance in highly resistant KB cells. J. Urol., 1994,151,
  15. 485.
  16. [7] Thiounn, N., Mathiot, C, Tartour, E., et al.: Phenotypic and functional analy-
  17. sis of tumour-infiltr ating lymphocytes from patients with rena cell carcinoma.
  18. Eur. Urol., 1994, 25,151.