Zmiany w następstwie kriochirurgii nerki królika
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1979/32/1.

Zmiany w żywych tkankach podczas zamrażania powstają dwiema drogami. Przy ochładzaniu do 10°C na minutę kryształki lodu tworzą się w przestrzeni pozakomórkowej (krystalizcja heterogenna), zwiększa­jąc znacznie stężenie elektrolitów (5, 11, 12). Woda przemieszcza się z komórek do przestrzeni międzykomórkowej, a komórki ulegają odwod­nieniu i obkurczeniu. Powolne zamarzanie powoduje rozległe zmiany martwicze, ale doświadczenia z użyciem zawiesin komórkowych wyka­zują odsetki ich przeżycia od 10 do 50% (11, 12). Przy szybkim zamra­żaniu ze spadkiem temperatury 40°C na min. kryształki lodu tworzą się zarówno w przestrzeni pozakomórkowej jak i w komórkach (krystaliza­cja homogenna). To powoduje zazwyczaj martwicę (11, 12). Obumieranie komórek przy szybkim zamrażaniu wydaje się być efektem utraty wody ze struktur komórkowych, prowadzącej do tworzenia się w nich krysz­tałków lodu. Powstaje toksyczne stężenie elektrolitów, zniszczenie biał­ka i błony komórkowej, unieczynnienie enzymów (12), a zmiany pow­stające w drobnych naczyniach krwionośnych prowadzą do martwicy niedokrwiennej (8, 12). Całość tych procesów nazwano krionekrozą.

Próby niszczenia tkanek nowotworowych podjęto w połowie XIX-go stulecia. Krionekrozę nowotworu dróg rodnych u kobiet próbował uzy­skać J. Arnot w 1851 r. stosując zbiornik solanki ochłodzonej lodem do 24°C. W 1883 r. S. Opęchowski zamrażał tkankę mózgową psów stosując aparat wyzyskujący efekt szybkiego parowania eteru w strumieniu ciepłego powietrza (4). Współcześnie J.S. Cooper użył w 1961 r aplikatora (kriosondy), której końcówka oziębiana była ciekłym azotem do 196°C. Z pracami Coopera związane są początki kriochirurgii (4, 8)

Zastosowanie kriosondy umożliwia dokładne zogniskowanie krańcowo niskiej temperatury na obszarze, który na powierzchni zamrażanej ma kształt okrągły, a przestrzennie hemisferyczny, przy czym objętość zamrażanej masy tkankowej zależy od czasu i średnicy aplikatora. Kriogenikę stosuje się w licznych obcych ośrodkach w zakresie dermatolokrwawienia. Stwierdzono, że jest to bezpieczny sposób operowania cho­rych ze skazą krwotoczną, podkreśla się jej wartość we wczesnym le­czeniu nowotworów, jak również w postępowaniu łagodzącym u cho­rych nieoperacyjnych (4, 8). Leczenie kriogeniczne w kraju zastosowano poza okulistyką (Krwawicz) tylko w nielicznych ośrodkach z powodu braku aparatury (1, 2, 8, 9, 10). Zainteresowania nasze wiążą się z moż­liwością uzyskania prototypu kriosondy o dużej wydajności cieplnej, wykonanej przez Zakład Niskich Temperatur Centralnego Ośrodka Tech­niki Medycznej w Warszawie (Kierownik Zakładu Doc. dr inż St. Augu-stynowicz). Prototyp ten testowano biologicznie, zamrażając przez 3 min. dolny biegun nerki królika. Narząd ten wybrano z powodu jego znako­mitego ukrwienia.

Sposób wykonania

Do doświadczeń użyto kriosondy o średnicy 10 mm. Ciśnienie robocze* aparatur wynosiło od 0,62 do 0,9 atm. Badania przeprowadzono u 15 królików obu płci, rasy mieszanej, wagi od 3,6 do 4,9 kg. Zwierzęta podzielono na 2 grupy.

Grupa I składała się z 4 zwierząt, a grupa II z 11 zwierząt. Zabiegi operacyjne wykonywano w znieczuleniu dotchawiczym, stosując dożyl­nie Nembutal w rozcieńczeniu 10 mg (1 ml) i prowadząc oddech kontro­lowany, powietrze+'tlen z użyciem respiratora dla małych zwierząt. Za­bieg operacyjny wykonywano w ułożeniu na boku. Cięciem lędźwiowym lewostronnym pozaotrzewnowo uwalniano i wyłaniano nerkę. Narząd zwilżano 0,9% rozczynem soli fizjologicznej, kriosondą dotykano dolny biegun nerki i uruchamiano aparat. Zwracano przy tym baczną uwagę, by kriosondą po przymarznięciu nie uciskała miąższu, oraz by szypuła naczyniowa nie była zagięta lub skręcona. W opisany sposób udało się zawsze utrzymać krążenie w nerce pomimo, iż jej biegun był zamraża­ny. Kriosondę wyłączano i po 3 min. Odmrożenie nerki następowało w sposób naturalny. W czasie zamrażania i odmrażania prowadzono spo­strzeżenia, notując czas (w sek.) i mierząc średnicę zamrożonej tkanki (w mm). Po odtajaniu nerki umieszczano narząd w łożysku. Powłoki zeszywano dwuwarstwowo szczelnie. Ranę operacyjną zabezpieczono pla­stykiem w aerozolu. Uprzednio zamrożoną nerkę I grupy zwierząt wy­cięto po upływie 15 min., 1, 12, oraz 24 godzin. Czynność nerek II gru­py zwierząt kontrolowano oznaczając w 7 , 14 i 28 dobie mocznik i kre­atyninę w surowicy krwi, oraz wykonując urografię w rozmaitych odstępach czasu od operacji. Wszystkie zwierzęta tej grupy przeżyły doświadczenie i były ponownie operowane. Podczas drugiego zabiegu cięciem poprzez bliznę wycinano uprzednio zamrożony narząd. Powtórną operację wykonano po tygodniu u 2, po 2 tygodniach u 3, po 4 tygod­niach u 2, oraz po 5 tygodniach u 4 pozostałych królików. Wszystkie fazy zamrażania i odmrażania były u licznych zwierząt wielokrotnie fo­tografowane.

Wyniki

Rąbek zamrożonej tkanki uwidaczniał się od 9 do 35 sek. (przeciętnie w 21 sek). od rozpoczęcia krioaplikacji. Po 1 min. zlodowaciała tkanka miała średnicę od 14 do 16 mm (przeciętnie 15,2 mm), po upływie 2 min. średnica lodowej hemisfery wynosiła od 20 do 26 mm (przeciętnie 23 mm.), po 3 min. średnica zamrożenia zwiększyła się od 27 do 36 mm. (przeciętnie 31,4 mm.). Początek odmrożenia w postaci ciemnoczerwo­nego prążka uwidaczniał się od 1 min. 30 sek. do 3 min. 15 sek. (prze­ciętnie 2 min. 17 sek.), kriosondą puszczała tkankę od 20 sek. do 5 min. 15 sek. (przeciętnie 2 min. 55 sek.) po wyłączeniu aparatu. Dopiero w 5 i 6 minucie odmrażanie przebiegało szybciej, zakończenie tego procesu spostrzegano między 6 min. 20 sek, a 13 min. 50 sek. (przeciętnie 9 min. 2 sek.) od wyłączenia krisondy. Odmrożona nerka zmieniała kolor na ciemno wiśniowy, objętość odmrożonej tkanki zwiększała się, ostro odgraniczając się od części nie zmienionej zimnem, przy czym odcinek kriogenicznie zmieniony wynosił od 1/5 do 1/4 nerki. Z torebki włóknistej sączyły się niekiedy drobniutkie kropelki krwi. Krwawienie to ustawało po kilkudziesięciu sekundach. Przed wycięciem nerki oznaczono w 7, 14 i 28 dobie poziom mocznika i kreatyniny w surowicy krwi.

W badaniach tych u żadnego zwierzęcia nie stwierdzono odchyleń od stanu zwykłego. Rany operacyjne zagoiły się doraźnie. Przed wycięciem nerki wykonywano urografię. Króliki układano w taki sposób, by trzewia były przesunięte na stronę prawą. Wielkość lewej nerki po podaniu kontrastu była mniejsza, wydzielanie jednoczasowe, równe. Urograficznie niemej nerki nie stwierdzono. W miejscu odpowiadającym dolnemu biegunowi nerki była luka, nie wypełniona moczem kontrastowym. Pod­czas powtórnej operacji po 24 godz. było nieco wysięku w łożysku nerki.

Tydzień po krioaplikacji stwierdzono wysięk w otoczeniu nerki, która w zakresie dolnego bieguna była w silnych płaszczyznowych zrostach trudnych do rozdzielenia. Zrosty te przecinano między podwiązkami. Po 14 dniach wysięku w otoczeniu nerki nie było. Narząd tkwił w mocnych zrostach z otoczeniem nie tylko w zakresie dolnego bieguna. Po 4 tygodniach zrosty nerki z otoczeniem były lite, twarde, obejmowały cały narząd, którego dolny biegun był wtopiony w tkanki otaczające. Po 5 tygodniach silne zrosty z otoczeniem były wyraźniejsze poza właściwym obszarem zamrożenia i obejmowały również u 1 królika ogon trzustki.

Dolny biegun nerki był wtopiony w otoczenie i wyczuwalny jako mały, twardy guzek. Na nerkach przekrojonych podłużnie I grupy zwierząt zmieniony zimnem zajmuje do 2/5 nerki, klinowo biegnie w kierunku miedniczki. Klin ten jest przekrwiony, obrzękły, odgraniczony dość ostro od nie zmienionego miąższu. W miedniczce nerkowej brak krwi.

Grupa II. Na rozkroju nerki 7 dni po krioaplikacji widoczny jest ostro odgraniczony klin dolnego bieguna w zrostach z otoczeniem. Krio­geńicznie zmieniony klin miąższu jest po 14 dniach blady, spoistości wzmożonej i wyraźnie mniejszy niż w nerkach grupy I. Na przekroju nerki po 4, a szczególnie po 5 tygodniach od krioaplikacji widać wyraź­nie regresję miąższu w zakresie dolnego bieguna. Biegun dolny nerki jest zwykle zmniejszony do wielkości fasoli, twardy, barwy szarej, nie do rozdzielenia z tkankami otaczającymi.

Omówienie

Wprowadzenie kriogeniki do lecznictwa winno opierać się na dokład­nie oznaczonej wydajności biologicznej istniejącej aparatury.

Pod wydajnością biologiczną rozumiemy efektywność zamrażania oraz jej bliższe i dalsze skutki. Dotychczasowe prace autorów polskich oma­wiały z jednym wyjątkiem (10) zastosowanie kriogeniki w lecznictwie (1, 2, 8, 9), nie dały jednak odpowiedzi w jakim czasie i na jakim przestrzennie obszarze dochodzi do kriodestrukcji tkankowej i gdzie ta gra­nica między kriodestrukcją (cryodestruction) z przeżyciem tkanki (cryopreservation) przebiega. Wiadomo, że gdzieś w pobliżu granicy pół­kuli lodowej przebiega linia dzieląca obszar zniszczony zimnem od warstwy brzeżnej komórek, które proces kriogeniczny przeżywają (6). Wybrany przez nas narząd odpowiadał założeniem pracy, bowiem dosko­nale ukrwiona nerka stanowi dużą przeszkodę cieplną podczas zamraża­nia. Ten sam czynnik przyspiesza znacznie odmrożenie, co znacznie zwiększa możliwość przeżycia zamrożonych tkanek na pobrzeżu lodowej półkuli (6). Spostrzeżenia drobnowidowe o rozmiarze i granicach znisz­czenia tkanek w opisywanym modelu kriogenicznie zmienionej nerki są przedmiotem innego doniesienia (5).

Spostrzeżenia zmian makroskopowych pozwalają ustalić, że wydajność kriogeniczna polskiego prototypu aparatu kriochirurgicznego jest wiel­ka, a średnica półkuli lodowej powstaje po 3 min. zamrażaniu przekra­cza z zasady ponad trzykrotnie średnicę użytej sondy kriogenicznej. Stwierdzono, że w okresie między 1 a 7 dobą pooperacyjną pojawia się dookoła dolnego bieguna nerki wysięg, ulegający wessaniu do 14 dnia po krioaplikacji. Ustalono u wszystkich kontrolowanych zwierząt, że odczyny zlepne z torebką tłuszczową — dość silne po tygodniu — stają się po 2 tygodniach lite, przy czym w 4 i 5 tygodniu po zamrożeniu dolnego bieguna nerki narząd ten jest wtopiony w twarde, niepodatne zrosty z otaczającymi tkankami. W urografiach uwidoczniono już po 7 dniach prawidłową czynność większej części nerki nie zmienionej krio­genicznie. Ponadto ustalono, że uprzednio zamrożony biegun nerki ulega stopniowemu zmniejszeniu szczególnie łatwo uchwytnemu 5 tygodni po zabiegu.

Wnioski

1. Prototyp polskiego aparatu krichirurgieznego wykonany przez Zakład Niskich Temperatur COTM jest wydajny, prosty i łatwy w użyciu oraz niezawodny.

2. Zmieniony na skutek zamrożenia dolny biegun nerki królika ulega kriodestrukcji, po czym procesy odnowy prowadzą do jego regresji i wtopienia się w tkanki otaczające.

3. Krioaplikacja dolnego bieguna nerki królika nie prowadzi do uchwytnych zaburzeń poziomu mocznika i kreatyniny, a dobra czynność wydalnicza pozostałej części nerki stwierdzona jest urograficznie od 7 dnia po operacji.

Podziękowanie

Autorzy pracy składają podziękowanie pracownikom Zakładu Niskich Tempe­ratur Centralnego Ośrodka Techniki Medycznej za ich pomoc przy realizacji omawianych badań.

1. Adamus J., Przywara St: Kriochirurgia w leczeniu nowotworów skóry. Poi. Tyg. Lek. 1973, 27, 440.
2. Adamus J., Przywara St, Godeł M.: Kriochirurgia w leczeniu nowotworów jamy ustnej. Otolaryngol. Pol. 1974, 28, 41.
3. Augustynowicz St.: Niektóre zastosowania techniki niskich temperatur w medycynie. Probl. Techn. Med. 1971, 2, 19.
4. Augustynowicz St., Szmurło Wl., Sochacka Z., Stryjecki J.: Zastosowanie kriotechniki w chirurgii. Probl. Techn. Med. 1973, 4, 1.
5. Salwa W., Kroll J., Gustowska L.: Ocena morfologiczna nerek królików po krio­aplikacji.
6. Lovelock J.: Preservation of freezing damage to living cells by diamethyl sulphoxide. Nature 1959, 183, 1394.
7. Miller R.H., Mazur P.: Survival of frozen — thawed human red cells as a function of cooling and warming velocities. Cryobiology 1976, 13, 404.
8. Przywara St., Adamus J.: Kriochirurgiczne leczenie popromiennych wznów raka skóry. Wiad. Lek. 1973, 26, 1173.
9. Przywara St., Godeł AT, Zygmunt J.: Wstępna ocena wyników leczenia nowotworów skóry i śluzówek jamy ustnej metodą kriochirurgiozną. Pol. Przegl. Chir. 1976, 48, 487.
10. Przywara St., Godeł M., Zygmunt J.: Kriochirurgia przełyku i wpustu żołądka w doświadczeniach na zwierzętach. Pol. Przegl. Chir. 1976, 48, 587.
11. Schrott K.M., Siegel A., Schmidt Th.: Das Verhaltniss zwischen Sondengrósse, Gefriergeschwindigkeit und Zelltod in der Kryotherapie. Der Urologe 1969, 8, 164.
12. Whittaker D.K.: Ice crystals formed in tissues during cryosurgery. Cryobiology 1974, 11, 192.