english version wersja do druku
	kwartalnik ISSN 0500-7208 Czasopismo punktowane przez KBN, Index Copernicus oraz w bazie GBL

Wstęp

Podmiedniczkowe zwężenie moczowodu jest jedną z najczęstszych wad układu moczowego u dzieci. Występuje z częstością od 1/1000 do 1/2000 urodzeń [1,2]. Nieco częściej występuje u chłopców niż u dziewczynek (1,2:1), częściej po stronie lewej. Obustronnie pojawia się u przeszło 10% chorych. Około 20% tego typu wad rozpoznawanych jest w pierwszych latach życia [3,4].

Patofizjologia tej wady nie jest do końca poznana. Jedną z jej przyczyn podawanych w piśmiennictwie jest rozrost tkanki łącznej w błonie podśluzowej połą- czenia miedniczkowo-moczowodowego bez współistnienia odczynu zapalnego. Konsekwencją tego stanu jest zastępowanie błony mięśniowej przez włókna kolagenowe, które znacznie zmniejszają kurczliwość ściany moczowodu. Nadmiernie rozwinięta tkanka łączna zwęża jego światło, co prowadzi do utrudnienia w przepływie moczu [5,6]. Inna teoria, podawana przez wielu badaczy, zakłada, że przyczyną niepowodzeń przechodzenia fal perystaltycznych z miedniczki do moczowodu jest zaburzenie koordynacji procesu przemieszczania moczu w górnych piętrach układu moczowego [2,7].

Mechanizm działania górnych dróg wyprowadzają- cych mocz jest bardzo zbliżony do układu bodźcoprzewodzącego serca [8]. Fale perystaltyczne powstają w ośrodkach rozrusznikowych, umiejscowionych w ścianie połączenia kielichowo-miedniczkowego i miedniczki nerkowej. Pobudzenia rozprzestrzeniają się w ścianie miedniczki imoczowodu za pośrednictwem komórek mięśni gładkich [7,9].

W miejscu połączenia miedniczki z moczowodem dochodzi do blokowania pojedynczych pobudzeń nadchodzą- cych z miedniczki nerkowej. Dopiero znaczny wzrost liczby pobudzeń generowanych przez ośrodki rozrusznikowe powoduje powstanie fali perystaltycznej, która przemieszcza się wzdłuż moczowodu do pęcherza moczowego, zapewniając jednokierunkowy przepływ moczu. Wzmożona aktywność ośrodków rozrusznikowych jest związana ze zwiększonym napływem moczu do miedniczki nerkowej, powodującym rozciągnięcie jej ściany. Uważa się, że analogicznie jak w układzie bodźcoprzewodzącym serca, pośrednią kontrolę nad mechanizmem tworzenia i rozprzestrzeniania fali perystaltycznej może pełnić autonomiczny układ nerwowy [2,9,10,11].

Część badaczy uważa, że zaburzenia czynnościowe są główną przyczyną utrudnienia przepływu moczu z miedniczki nerkowej do moczowodu [5,12].

Mimo rozwoju metod diagnostycznych, nie do końca poznana jest funkcja, jaką pełni układ nerwowy w górnych drogach wyprowadzających mocz.

Ponieważ piśmiennictwo dotyczące zaburzenia rozmieszczenia struktur nerwowych w ścianie moczowodu jest nieliczne, postanowiono ocenić unerwienie ściany w podmiedniczkowych zwężeniach moczowodu i porównać je z moczowodami prawidłowymi.

Cele pracy

1. Ocena unerwienia ściany moczowodu w zwężeniu połączenia miedniczkowo-moczowodowego u dzieci z wodonerczem wrodzonym.

2. Porównanie liczby struktur nerwowych w moczowodach ze zwężeniem i w moczowodach prawidłowych.

3. Porównanie unerwienia ściany moczowodu w podmiedniczkowym zwężeniu moczowodu u dzieci młodszych (3-7 lat) i starszych (8-12 lat.)

Pacjenci i metody

Grupę badaną stanowiło 50 dzieci w wieku od 3 do 12 lat, leczonych operacyjnie w Klinice Chirurgii i Onkologii Dziecięcej IP UM z powodu wodonercza wrodzonego. Dzieci podzielono na dwie grupy - dzieci młodszych do siódmego roku życia (29 pacjentów) i dzieci starszych - powyżej siódmego roku życia (21 pacjentów). Dzieci te po badaniach diagnostycznych (USG, urografia, renoscyntygrafia, cystografia) poddane zostały planowym zabiegom operacyjny, polegającym na resekcji zwężonego odcinka moczowodu i plastyce połączenia miedniczkowo-moczowodowego. Grupę porównawczą stanowiło 10 dzieci, u których została usunięta nerka wraz z moczowodem po urazie lub w wyniku choroby nowotworowej z niezmienionym moczowodem.

Resekowane odcinki zwężonych moczowodów u dzieci utrwalono w 10% zbuforowanej formalinie i zatopiono wbloki parafinowe. Skrawki parafinowe o grubości 3-4 mikrometrów posłużyły do sporządzenia preparatów barwionych rutynowo hematoksyliną i eozyną (HE) i do badań immunohistochemicznych, przeprowadzonych według metody immunoperoksydazowej, opisanej przez Hsu i wsp.

Do badań immunohistochemicznych skrawki parafinowe poddawane były odparafinowaniu w szeregu alkoholi (alkohole o zmniejszającym się stężeniu 96-60%). Następnie hamowano aktywność endogennej peroksydazy przez 5 minut, przy użyciu wody utlenionej w metanolu.

W celu odzyskania właściwości antygenowych skrawki podgrzewano w 0,01 M buforze cytrynianowym o ph 6 (w kuchence mikrofalowej przez 20 minut przy poziomie mocy 650 W). Po ostudzeniu preparaty płukano 0,005 M buforem TrisHCL (TBS) o ph 7,6.

Skrawki inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi, PGP 9,5 (1: 20) i NGF-R (1:50) firmy Novocastra przez 30 minut (w temperaturze pokojowej) w wilgotnej komorze. Następnie preparaty dwukrotnie płukano buforem TBS. Dla uwidocznienia wyżej wymienionego antygenu użyto systemu wizualizacji firmy DacoCytomation. Reakcję barwną wywołano przy użyciu substratu dla peroksydazy 3,3'tetrachlorekdiaminobenzydyny (DAB). Potem podbarwiono jądra komórkowe hematoksyliną Meyera. Po wypłukaniu preparatów pod bieżącą wodą odwadniano je w szeregu alkoholi o rosnących stężeniach, po czym przeprowadzono przez szereg acetonów i ksylenów. Tak przygotowane preparaty zatopiono w balsamie kanadyjskim i poddano ocenie mikroskopowej.

Preparaty oceniane były pod mikroskopem świetlnym Nikon Microphot FXA w powiększeniu 200 razy z zastosowaniem komputerowej metody wizualizacji i obróbki obrazu MultiScanBase v. 8.08.

W każdym preparacie wykonanym z przekroju poprzecznego moczowodu oceniano następujące warstwy: nabłonek z warstwą podśluzową (pole I), błona mięśniowa (pole II) i okolicę przydanki (pole III). W każdej z badanych warstw oceniano pięć pól widzenia, z których wyliczano średnią liczbę widocznych struktur nerwowych, wykazują- cych ekspresję PGP 9.5 i NGF-R.

Za pomocą testu niesparowanego przeprowadzono analizę statystyczną uzyskanych wyników, porównując odpowiednio pola I, II, III dla grupy badanej i kontrolnej.

Wyniki

We wszystkich preparatach barwionych standardowo HE stwierdzono nadmiernie rozwiniętą tkankę łączną w błonie mięśniowej ściany moczowodów, pochodzą- cych od dzieci z wodonerczem (ryc. 1 i ryc. 2). Dodatnie reakcje immunohistochemiczne, ukazujące włókna nerwowe w ścianie moczowodu przedstawiają ryc. 3 i ryc. 4.

W polach I, II, III w prawidłowych moczowodach stwierdzono znacznie większą liczbę włókien nerwowych wykazujących ekspresję PGP 9.5 i NGF-R w przeciwieństwie do moczowodów stenotycznych.

Stwierdzono, że liczba włókien nerwowych w warstwie podśluzowej w zwężonych odcinkach moczowodów była dużo mniejsza niż w warstwie mięśniowej. Podobnie jak w polu III, gdzie okolica przydanki była bardziej uboga we włókna nerwowe wykazujące ekspresję wymienionych markerów w stosunku do pól warstwy mięśniowej. Jednak największą różnicę unerwienia ściany moczowodu stwierdzono w zakresie błony mięśniowej grupy badanej i kontrolnej. W grupie badanej liczba struktur nerwowych była zdecydowanie mniejsza w stosunku do grupy kontrolnej (tab. I, tab. II, ryc. 5, ryc. 6).

W obu grupach dzieci (badanej i kontrolnej) zaobserwowano w warstwie podnabłonkowej dodatnią reakcję NGF-R, która odpowiadała komórkom dendrytycznym, a średnie wartości z pól I, II, III wysoce znamienne różnice statystyczne p<0,001, przy nieznamiennym błędzie statystycznym.

W preparatach pochodzących od dzieci z wodonerczem z grupy wiekowej powyżej siedmiu lat obserwowano mniej struktur nerwowych niż w grupie poniżej siedmiu lat. Jednak różnice te były niewielkie i nieznamienne statystycznie (tab. III, tab. IV, ryc. 7, ryc. 8).

Omówienie

Nie jest do końca wyjaśniona przyczyna zaburzeń w przemieszczaniu moczu na odcinku połączenia miedniczkowo- -moczowodowego, a dyskusja na ten temat wciąż pozostaje otwarta. Mimo że opisano już wiele teorii wyjaśniających przyczynę tej wady, w świetle doniesień z ostatnich lat zaczyna przeważać pogląd, że zwężenie miedniczkowo-moczowodowe jest pochodzenia czynnościowego [2,5,11]. Za taką koncepcją mogą przemawiać zarówno obserwacje kliniczne, jak i badania immunohistochemiczne. Niejednokrotnie podczas zabiegu operacyjnego udaje się przejść sondą lub cienkim cewnikiem przez miejsce, w którym badania obrazowe jednoznacznie wykazały zwężenie [2].

Zaburzeniu przechodzenia fali perystaltycznej przez po- łączenie miedniczkowo-moczowodowe towarzyszy znaczne utrudnienie w odpływie moczu z miedniczki. W wyniku tej wady dochodzi do zalegania moczu wmiedniczce nerkowej [4]. Długotrwałe utrudnienie w opróżnianiu się miedniczki nerkowej może prowadzić do zaniku kory nerki i powstania uropatii zaporowej.

Mechanizm powstawania i rozprzestrzeniania się fali perystaltycznej zawsze był bardzo dyskusyjnym zagadnieniem dotyczącym fizjologii moczowodu. W górnych drogach wyprowadzających mocz zidentyfikowano ośrodki mające zdolność do samowzbudzania [7,8,9]. Są one odpowiedzialne za nadawanie rytmu fali perystaltycznej, jednak że uważa się, że kontrolę nad tymi strukturami pełni autonomiczny układ nerwowy. W wielu pracach dowodzono, że unerwienie ściany miedniczki nerkowej i moczowodu jest zbyt słabe, aby nadzorować proces przemieszczania moczu z miedniczki nerkowej do pęcherza moczowego. Sugerowano wręcz, że proces ten jest całkowicie niezależny od kontroli nerwowej. Obecnie badania coraz częściej wskazują na neurogenną teorię kontroli perystaltyki w górnych odcinkach układu moczowego [14].

Stwierdzono obecność dwóch splotów autonomicznych rozmieszczonych podobnie jak w ścianie jelit. Pierwszy splot zlokalizowany jest w warstwie podśluzowej, drugi w błonie mięśniowej. Oba sploty połączone są licznymi włóknami łączącymi, które tworzą śródścienną strukturę sieci neuronalnej [2]. W warstwie mięśniowej i pod przydanką zlokalizowane są pojedyncze zwoje nerwowe [15].

Szczególną uwagę zwraca dość obfite unerwienie dośrodkowe w obrębie miedniczki i miejsca, gdzie łączy się ona z moczowodem. Zakończenia nerwowe włókien aferentnych zlokalizowane są pomiędzy komórkami nabłonkowymi. Ich liczba zmniejsza się w kierunku pęcherza moczowego. Unerwienie dośrodkowe, będące w autonomicznym układzie nerwowym częścią łuków odruchowych, może być ważnym elementem neuronalnej kontroli perystaltyki moczowodowej [10,11].

W ścianie górnego odcinka dróg moczowych zlokalizowano unerwienie przywspółczulne, które - tak jak w przewodzie pokarmowym - może być odpowiedzialne za utrzymywanie napięcia ściany. Unerwienie współczulne reprezentowane jest przez zazwojowe włókna bezrdzenne [16].

Zastosowanie przez autorów nowoczesnych wysokospecyficznych markerów struktur nerwowych, takich jak PGP 9,5 i NGF-R, pozwoliło lepiej poznać unerwienie ściany moczowodu.

NGF-R jest receptorem dla neurotropowego czynnika wzrostu NGF, który jest niezbędny do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania aksonów oraz zakończeń synaptycznych. Ekspresja NGF-R jest szczególnie dobrze wyrażona w lemmocytach osłonki Schwanna i aksonach neuronalnych [17]. PGP 9,5 jest wysoce specyficznym białkiem występującym na wszystkich poziomach centralnego i obwodowego układu nerwowego w cytoplazmie neuronów i włóknach nerwowych. Białko to jest bardzo użyteczne przy badaniu wielu chorób neurodegeneracyjnych [18,19].

W przeprowadzonych badaniach stwierdzono, że w grupie kontrolnej największa koncentracja włókien nerwowych występowała w błonie mięśniowej. W porównaniu z tym liczba włókien wykazujących ekspresję PGP 9,5 i NGF-R była wyraźnie mniejsza w stenotycznej części moczowodu pochodzącego od dzieci z wodonerczem.

Tak duża różnica w unerwieniu ściany moczowodu w grupie badanej w stosunku do moczowodów prawidłowych może być spowodowana długotrwałym procesem włóknienia połączenia miedniczkowo-moczowodowego. Nasz materia ł pochodził od pacjentów, u których choroba trwała już kilka lat. Potwierdzeniem tego może być fakt, że w preparatach pochodzących od dzieci z wodonerczem z grupy wiekowej powyżej siedmiu lat stwierdzono mniej struktur nerwowych niż w grupie poniżej siedmiu lat. Rozwijające się włókna kolagenowe przez uciskanie struktur nerwowych mogły powodować ich zwyrodnienie i zanik. Jednak nie udowodniono jeszcze zależności między natężeniem rozwoju tkanki łącznej a zaburzeniem unerwienia ściany moczowodu.

Znaczne zredukowanie włókien nerwowych może być główną przyczyną zaburzenia przechodzenia fali perystaltycznej przez zwężony odcinek moczowodu [2,5,11].

Dane przedstawione przez autorów pracy są następnym argumentem przemawiającym za czynnościową przyczyną wodonercza wrodzonego u dzieci.

Wnioski

W opisywanym badaniu użycie przez autorów metod immunohistochemicznych pozwoliło wykazać zaburzenia unerwienia zwężonej ściany podmiedniczkowej części moczowodu u dzieci z wodonerczem wrodzonym. Dane te sugerują, że autonomiczny układ nerwowy może odgrywać znaczącą rolę w prawidłowym transporcie moczu z miedniczki nerkowej do pęcherza moczowego. Dalsze badania unerwienia górnego odcinka układu moczowego mogą przyczynić się do lepszego poznania przyczyn nieprawidłowego przemieszczania się moczu przez połączenie miedniczkowo- moczowodowe.

1. Gosling JA and Dixon JS: Functional obstruction of the ureter and renal pelvis. A histological and electron microscopic study. Br J Urol 1978; 50: 145.
2. Nemeth L, O'Briain DS, Puri P: Demonstration of neuronal networks in the human upper urinary tract using confocal laser scanning microscopy. J Urol 2001; 166 (1): 255-258.
3. Ben-Chaim J, Gearhart JP: Upper urinary tract. In: Surgery of Infants and Children: Scientific Principles and Practice. Edited by Oldham KT, Colombani PM, Foglia R, P. Philadelphia: Lippincott- Raven, 1997 p. 1481.
4. Antonakopoulos, GN, Fuggle WJ, Newman J et al: Idiopathic hydronephrosis. Light microscopic features and pathogenesis. Arch Pathol Lab Med 1985, 109: 1097.
5. Murakumo M, Nonomura K, Yamashita et al: Strucrural changes of collagen components and diminution of nerves in congenital ureteropelvic junction obstruction. J Urol 1997,157: 1963-1968.
6. Wang Y, Puri P, Hassan J et al: Abnormal innervation and altered nerve growth factor messenger ribonucleic acid expression in ureteropelvic junction obstruction. J Urol 1995; 154: 679-83.
7. Solari V, Piotrowska AP, Puri P: Altered expression of interstitial cells of cajal in congenital ureteropelvic junction obstruction. J Urol 2003; 1: 2420-2422.
8. Megan F, Klemm, Betty Exintaris, RJ Lang: Identification of the cells underlying pacemaker activity in the guinea-pig upper urinary tract. The Journal of Physiology 1999; 519.3: 867-884.
9. Lammers WJEP, Ahmad HR, Arafat K: Spatial and temporal variations in pacemaking and conduction in the isolated renal pelvis. Am J Physiol Renal Physiol 1996; 270: 567-574.
10. Rolle U, Chertin B, Nemeth L, Puri P: Demonstration of nitrergic and cholinergic innervation in whole-mount preparations of rabbit, pig, and human upper urinary tract. Pediatr Surg Int 2002; 18 (5-6): 315-318.
11. Rolle U, Andersen HL, Puri P, Djurhuus JC: Innervation of congenitally hydronephrotic and normal porcine upper urinary tract. BJU Int 2002, 89: 566-570.
12. Lang RJ, Exintaris B, Teele ME et al: Electrical basis of peristalsis in the mammalian upper urinary tract. Clin Exp Pharmacol Physiol 1998, 25: 310-321.
13. Lammers WJEP, Ahmad HR, Arafat K: Spatial and temporal variations in pacemaking and conduction in the isolated renal pelvis. Am J Physiol Renal Physiol 1996, 270: 567-574.
14. Golenhofen K, Hannappel J: Normal spontaneous activity of the pyeloureteral system in the guinea-pig. Pflugers Arch 1973; 341: 257-270.
15. Karahan ST, Krammer HJ, Kuhnel W: Immunohistochemical demonstration of nerves and nerve cells in human and porcine ureters. Anat Anz 1993; 175: 259-262.
16. Rolle U, Brylla E, Tillig B: Immunohistochemical detection of neuronal plexuses and nerve cells within the upper urinary tract of pigs. BJU Int 1999; 83: 1045-1049.
17. Antunes SL, Liang Y, Neri JA et al: The expression of NGFr and PGP 9.5 in leprosy reactional cutaneous lesions: an assessment of the nerve fiber status using immunostaining. Arq Neuropsiquiatr 2003; 61 (2B): 346-352.
18. Krammer HJ, Karahan ST, Rumpel E et al: Immunohistochemical visualization of the enteric nervous system using antibodies against protein gene product (PGP) 9.5. Anat Anz 1993; 175: 321-325.
19. Dixon JS, Canning DA, Gearhart JP, Gosling JA: An immunohistochemical study of the innervation of the ureterovesical junction in infancy and childhood. Br J Urol 1994; 73: 292-297

Marek Krakós
Klinika Chirurgii i Onkologii Dziecięcej
ul. Sporna 36/50
91-738 Łódź
tel. (0 42) 617 77 05
marek.krakos@surgery.pl