english version wersja do druku
	kwartalnik ISSN 0500-7208 Czasopismo punktowane przez KBN, Index Copernicus oraz w bazie GBL

WPROWADZENIE Na krajowym rynku farmaceutycznym brak jest odpowiednika preparatu Prostamer®. Stanowi on połączenie dwóch surowców leczniczych, zarejestrowanych jako odrębne preparaty (Prostogal, Ekogal). Olej z nasion dyni (Oleum cucurbitae) jest od szeregu lat stosowany w lecznictwie pod postacią preparatów Pepostcrol, Prostogal, Pumpkin seed oil i innych, jako środek wspomagający w łagodzeniu objawów podrażnicniowych w łagodnym przeroście gruczołu krokowego (BPH). Olej zawiera niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe (NNKT) i fitoste-role, zwłaszcza 6-sitosterol i jego połączenia glikozydowe. Z powodu wysokiej zawartości tokoferoli (w nasionach 30 mg%) olej zachowuje trwałość bez dodatku prze-ciwutleniaczy. Obecność wymienionych składników (fito-steroli, NNKT oraz wit. E) stała się podstawą do stosowania Oleum Cucurbitae w łagodnym przeroście gruczołu krokowego z nawracającymi stanami zapalnymi dolnych dróg moczowych i zaburzeniami mikcji. Preparaty zawierające 6-sitosterol i inne fitosterole stosowane są w dawkach 20-50 mg do leczenia objawowego BPH, zwłaszcza I i II okresu. Łagodzą objawy podrażnienia ze strony pęcherza i cewki moczowej [1,2,3,4,5,6,7]. Według badań Schilchera i wsp. [8] oraz Santera [6] zarówno 6-sitoste-rol, jak i jego glikozydowe połączenia, zwłaszcza 6-D-gl-ukopyranozylo-5a-stigma-7,22-dien-3B-ol, wykazują działanie przeciwzapalne i przeciwbakteryjne, a jeden z A7 steroli wykazuje wyraźne działanie diuretyczne (badania prowadzono w porównaniu do hydrochlorotiazydu). Związki zawarte w oleju poprawiają także szybkość wypływu moczu oraz stopień opróżnienia pęcherza moczowego [6,8,9]. Jest to odczuwalne zwłaszcza w pierwszym okresie schorzenia. Mechanizm działania leków zawierających fitosterole nie został dokładnie poznany. Przypuszcza się, że związany jest on zarówno z działaniem przeciwzapalnym, jak i wpływem na gospodarkę hormonalną - na działanie 5a reduktazy [7,8,10,11,12]. Podawanie pacjentom preparatów, zawierających mieszaninę steroli (uzyskanych z nasion dyni), powodowało wyraźne obniżenie stężenia dihydrotestosteronu w tkankach prostaty. Badania laboratoryjne wykazał}\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\', że stosowanie preparatów zawierających olej lub wyciągi z nasion dyni w przeroście BPH, zmniejszało częstotliwość oddawania moczu w nocy [6,7,13] i objętość moczu, zalegającego w pęcherzu oraz zwiększało szybkość jego przepływu. Stwierdzono ponadto subiektywną poprawę samopoczucia pacjentów, zwłaszcza jeśli ustępowały objawy nad--reaktywności pęcherza [3,7,9]. Drugim składnikiem preparatu jest olej z wątroby rekina (Somniosus miaocephalus). Olej z wątroby niektórych gatunków rekinów był od dawna stosowany w medycynie ludowej krajów skandynawskich jako środek ułatwiający gojenie się ran, w schorzeniach infekcyjnych, a także w obrzęku węzłów chłonnych. Badania oleju, prowadzone od lat dwudziestych ubiegłego wieku, wykazały że odpowiedzialne za działanie są alkiloglicerolc, różniące się od tłuszczy charak- terem wiązania (eterowe) oraz obecnością charakterystycznych alkoholi: chimylowego, batylowego i selachylowego, przy czym ten ostatni zawiera wiązania nienasycone, co wpływa dodatkowo na jego skuteczność [14]. Ze względu na lipofilny charakter alkiloglicerole mają powinowactwo do błon komórkowych [15]. Wpływają na aktywność enzymów i niektórych białek występujących w Wonie komórkowej i biorących udział w przekazywaniu sygnałów. Dotyczy to kinazy proteinowej, ATP-azy czy fosfolipazy, a także - RAF. Ze względu na inhibicyjny charakter działania na niektóre enzymy, alkiloglicerole wpływają na zwiększenie przepuszczalności błon komórkowych oraz na mechanizmy regulujące wzrost komórki. Alkiloglicerole kumulują się wybiórczo w błonach komórek nowotworowych dzięki powinowactwu do błon lipi-dowych. a także z powodu mniejszej zawartości w tych błonach enzymów rozkładających wiązania eterowe, które występują w cząsteczkach alkilogliceroli [14,16]. Zwiększając przepuszczalność błon komórkowych, ułatwiają przenikanie leków do wnętrza komórki. Jak wykazaliśmy w poprzednich pracach [17,18], olej z wątroby rekina obniża aktywność angiogenną komórek nowotworowych, co może mieć znaczenie w przypadku podawania go chorym z chorobą nowotworową, ponieważ neoangiogeneza jest istotnym elementem wzrostu guzów i powstawania przerzutów. Wykazaliśmy również, że niektóre oleje roślinne mogą w pewnych warunkach działać odwrotnie. Olej z nasion wiesiołka dziwnego, stosowany miejscowo, pobudzał aktywność angiogenną komórek ludzkich nowotworów w teście skórnej angioge-nezy u myszy [19], nie wpływając jednakże na wzrost doświadczalnego mięsaka L-l przy podawaniu ogólnym (praca na ten temat jest przygotowywana do druku). Olej z nasion dyni nie był badany. CEL PRACY Celem obecnej pracy było przebadanie: preparatu o nazwie Prostamer®, mieszaniny oleju z nasion dyni i oleju z wątroby rekina, a także jego obu pojedynczych składników, w teście skórnej angiogenezy indukowanej u myszy Balb/c komórkami syngenicznego mięsaka L-l oraz sprawdzenie, jak podawanie tych preparatów wpłynie na rozwój i ukrwienie badanego nowotworu. MATERIAŁ I METODY Prostamer® jest mieszaniną w stosunku 1:1 oleju z nasion dyni i oleju z wątroby rekina, produkowaną przez firmę GAL (Poznań). Wytwórcą oleju z nasion dyni, tłoczonego na zimno, jest firma GAL. Olej zawiera niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe (NNKT) i fitosterole, zwłaszcza beta-sitosterol. Dostawcą oleju z wątroby rekina grenlandzkiego jest firma BL BergLipid Alesuncl z Norwegii. Olej zawiera alkiloglicerole; nie ma zaś cholesterolu. Zawartość skwalenu wynosi 2-3%. Badano następujące preparaty firmy GAL: odczynnika Drabkina. Odczytu dokonywano w spektrofotometrze SLT 936 PR przy długości fali 570 nm. 1. Prostamer® seria 010300 2. Prostamer® seria 010101 3. Ekogal® - olej z wątroby rekina grenlandzkiego - seria 01 0199 4. Prostogal® - olej z pestek dyni - seria 01 0799 Stosowane dawki: 4 ul lub 8 ul na mysz/dobę podawane myszom pipetą Eppendorffa doustnie (co, po przeliczeniu uwzględniającym różnice stosunku wagi ciała do jego powierzchni, występujące pomiędzy człowiekiem i myszą, odpowiada w przybliżeniu 2 ml lub 4 ml podanym człowiekowi o wadze 70 kg). Myszom, należącym do grup kontrolnych, podawano doustnie pipetą 8 mikroli-trów wody. Badania przeprowadzono na myszach szczepu Balb/c w wieku 7-9 tygodni, ważącym ok. 20 g, samcach i samicach. Myszy pochodziły z własnej hodowli wsobnej, a materiał zarodowy z Centrum Onkologii w Warszawie. Linię komórkową L-l Sarcoma otrzymano z banku komórek Centrum Onkologii i pasażowano początkowo in vitro, a następnie in vivo na myszach Balb/c. Do doświadczeń używano komórek uzyskanych z guzów po drugim, trzecim i czwartym pasażu in vivo. Zawiesiny komórek uzyskiwano z pasażowanych guzów usuwanych 14. dnia po wszczepieniu 2 milionów komórek w okolicę pod-łopatkową. Guzy przecierano przez metalowe sito, otrzymaną zawiesinę przesączano przez gazę młyńską, płukano dwukrotnie, wirując przez 10 min. przy 300 g i zawieszano w płynie Parkera. Zawiesiny komórek guzów, przygotowane jak wyżej, wszczepiano myszom (1 milion komórek w okolicę podłopatkową). Myszom podawano badane preparaty lub wodę przez 14 dni, a następnie uśmiercano Morbitalem. Począwszy od 7. dnia po wszczepieniu komórek dokonywano pomiarów objętości guzów (elektroniczna suwmiarka). Po usunięciu guzów i zmierzeniu ich masy i objętości oznaczano w nich zawartość hemoglobiny. W skrócie, tkankę guza homogenizowano przy użyciu sonifikatora ultradźwiękowego VirSonic, a następnie wirowano przez 20 minut (4000 rpm). Supernatant łączono (20 mikrolitrów) z 5 ml zmodyfikowanego Badanie wpływu preparatów na wzrost i ukrwienie sarcoma L-l przeprowadzono u 173 myszy, którym podawano Prostamer® (75 myszy), Ekogal (20 myszy), olej z dyni (20 myszy) lub wodę (58 myszy). Test skórnej angiogenezy przeprowadzano metodą opisaną przez Sidky i Auerbacha (20) w modyfikacji własnej [21]. W skrócie, myszy Balb/c usypiano wodzianem chlora-lu. Zawiesiny komórek, uzyskiwane jak wyżej, wszczepiano śródskórnic (200 tys. komórek w 0,05 ml) w 2-4 miejsca na ogolonej powierzchni grzbietu. Myszom podawano przez 3 dni badane preparaty lub wodę (kontrola). Po 72 godzinach myszy usypiano letalną dawką Morbitalu i dokonywano odczytu angiogenezy na wewnętrznej powierzchni skóry w mikroskopie operacyjnym, licząc nowo utworzone naczynia krwionośne (krótkie, kręte, rozgałęzione, skierowane do miejsca wszczepu komórek). Obrazy, uzyskane za pomocą kamery cyfrowej podłączonej do mikroskopu, zapisywano na dysku twardym komputera PC i weryfikowano wyniki, stosując program Mouse Observer [22]. Łącznie wykonano i odczytano 94 testy przeprowadzone na 30 myszach, którym Prostamer® podawano przez 3 dni po wszczepieniu komórek (10 myszy, 37 testów), Ekogal (5 myszy, 12 testów), olej z dyni (5 myszy, 11 testów) lub wodę (10 myszy, 34 testy). WYNIKI Analiza statystyczna wyników. Wyniki opracowano przy użyciu testów t-Studenta i U Manna-Whitney\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\'a. Myszy karmione oboma seriami PROSTAMERU® w dawce dobowej 4 mikrolitrów miały guzy mniejsze niż myszy grupy kontrolnej - w pomiarach dokonywanych 7., 9. i 11. dnia po wszczepieniu komórek nowotworowych (ryc. 1). Różnice te znikały w dniu piętnastym; nic stwierdzano również w tym dniu różnicy pomiędzy masą guzów doświadczalnych a kontrolnych i pomiędzy zawartością hemoglobiny w guzach pobranych od myszy grup kontrolnych a doświadczalnych. U myszy karmionych wyższą dawką (8 mikrolitrów) guzy nie tylko miały mniejszą objętość, ale pojawiały się później, niż w grupie kontrolnej (ryc. 2), najpóźniej zaś w grupie karmionej serią 010101, gdzie w siódmym dniu tylko 28% zwierząt miało widoczne guzy, w porównaniu z 60% w grupie kontrolnej. Piętnastego dnia po wszczepieniu komórek nowotworowych średnia objętość guzów grup karmionych wyższą dawką PROSTAMERU® była statystycznie istotnie niższa niż w grupie kontrolnej, podobnie jak i ich masa (tabela 1). Nie stwierdzono różnic w stężeniu hemoglobiny. W tabeli 2. przedstawiono wyniki badań przeprowadzonych u myszy z guzem, które były karmione składnikami Prostameru®, Ekogalem lub olejem z dyni (Prosto-galem). Nie stwierdzono wpływu tych preparatów na objętość guzów w dniach 8., 11. i 13. po wszczepieniu komórek, choć oba preparaty wykazywały tendencję do obniżenia wielkości guzów (różnice nie były istotne statystycznie z powodu dużego rozrzutu wyników). W tabeli 3. przedstawiono wyniki badań wpływu Prostameru® na aktywność angiogenic komórek nowotworowych, czytaną trzydniowym testem skórnej angiogene-zy. Stwierdzono przy tym zmniejszenie liczby nowoutworzonych naczyń w grupie myszy karmionych dawką dobową 8 mikrolitrów. W tabeli 4. umieszczono wyniki badań wpływu oleju z dyni i Ekogalu na odczyn skórnej angio-genezy. Żaden ze składników Prostameru® w dawce 4 mikrolitrów, odpowiadającej ich zawartości w preparacie złożonym (4 mikrolitry oleju z dyni i 4 mikrolitry Ekogalu w 8 mikrolitrach Prostameru®), nie wpłynął na wielkość odczynu skórnej angiogenezy. OMÓWIENIE WYNIKÓW Test skórnej angiogenezy pozwala śledzić najwcześniejszy jej etap-rekrutację komórek śródbłonka naczyń skóry przez czynniki uwalniane z wszczepionych komórek [20]. Podobna sytuacja ma miejsce w procesie una-czyniania przerzutów nowotworowych i guza pierwotnego. PROSTAMER® w dawce 8 mikrolitrów (w tym 4 mikrolitry oleju z wątroby rekina) istotnie statystycznie obniżył odczyn neowaskularyzacji, podobnie jak to stwierdziliśmy uprzednio, badając preparaty zawierające tylko olej z wątroby rekina, ale podawane w wyższych dawkach [17,18]. Jednakże w przypadku skojarzenia oleju wątroby rekina z olejem z dyni uzyskano efekt synergistyczny - niska dawka 4 mikrolitrów, która nie wpływała hamująco ani na angiogenczę skórną, ani na wzrost guzów, w połączeniu z olejem z nasion dyni, również nie wykazującymżadnego efektu w powyższych testach, dała wyraźny efekt hamujący wczesny etap angiogenezy i rozwój guzów. Wydaje się, że kombinacja składników, zastosowana w preparacie PROSTAMER®, jest korzystna z wielu względów. Olej z wątroby rekina, dzięki działaniu immunostymu-lującemu [23,24], może być przydatny w likwidowaniu stanów infekcji pęcherza i cewki moczowej, towarzyszących przerostowi prostaty, a olej z nasion dyni - ze względu na działanie łagodzące objawy podrażnienia pęcherza, noctu-rię i zaleganie moczu w pęcherzu. Oba składniki preparatu nie wykazują właściwości toksycznych, co potwierdza kilkusetletnie stosowanie ich w medycynie ludowej i ich badania toksykologiczne. Nasiona dyni, jak również wytwarzany z nich olej, są produktami spożywczymi, stosowanymi przez człowieka od wieków. Brak jest doniesień na temat toksyczności oleju tłoczonego na zimno z nasion właściwej jakości (o niskiej zawartości kukurbitacyn). Badania przedstawione w niniejszej pracy wskazują na możliwość zastosowania tego preparatu nie tylko u chorych z łagodnym przerostem prostaty, ale również, być może, jako leku wspomagającego leczenie chorób nowotworowych układu moczowo-płciowego. Sprawą do wyjaśnienia pozostaje, w jakim stopniu obserwowane w obecnej pracy hamowanie wzrostu guza jest związane z aktywnością anty-angiogenną kombinacji alkiloglicerolc/beta-sit- osterol. W grę mogą wchodzić jeszcze inne mechanizmy, takie jak pobudzenie apoplozy lub hamowanie proliferacji komórek nowotworowych [25,26,27], opisywane dla naturalnych i syntetycznych alkilogliceroli (eterów lipidowych). W piśmiennictwie nie znaleziono prac poświęconych badaniu wpływu mieszaniny oleju z wątroby rekina i oleju z nasion dyni na rozwój nowotworów i aktywność angiogenną ich komórek, brak również danych, dotyczących wpływu takiej mieszaniny na procesy apoptozy i proliferacji. WNIOSKI PROSTAMER® jest bezpiecznym lekiem, nie pobudzającym aktywności angiogennej komórek L-l sarcoma, i nie pobudzającym wzrostu tego nowotworu. Przeciwnie; dawka, odpowiadająca dawce zalecanej przez producenta, zmniejszała wielkość rosnących guzów, a dawka dwukrotnie większa dodatkowo opóźniała ich pojawienie się i hamowała wczesny etap angiogenezy. Karmienie myszy PROSTAMEREM® nie miało wpływu na ukrwienie guzów. Efekty te wydaja, się mieć swoje źródło w synergistycznym działaniu obu składników PRO-STAMERU®. Praca została wykonana w ramach zadania badawczego 4/4 Instytutu Gruźlicy i Chorób Pluc.

1. 1. Borkowski B: Rośliny lecznicze w filoterapii. IRiPZ, wyd. II, Poznań 2000; 308.
2. 2. Physician ReferenI Desk (PDR) for Herbal Medicines, Medical Economic Company 1999; 784-785.
3. 3. Berges RR, Windier J, Trampish HJ, Senge T: Randomised placebo-controlled, double-blind clinical trial of b-sitostero! in patients with benign prostatic hyperplasia.Lancet 1995, 345:1529-1532.
4. 4. Hansel R, Slicher O, Stcinegger E: Phaimakognosie - Phy-topharmazie 6 aufi. Berlin; Heidelberg; New York; Barcelona; Hong-Kong; London; Mailand; Paris; Singapur; Tokio Springer Verl. 1999 Hansel R kap. 3 Lipide 239-265.
5. 5. Loew D, Rietbrock N: Phytophaimaka in Forschung und Klinscher Anwendung Sleinkopf. Darmstadt 1995 Koch E kap I Pharmakologic und Wirkmechanismen von Extrakten aus Sabalfruchten (Sabal fructus), Brennesselwurzeln (Urti-eae radix) und Kurbissamen (cucurbitae peponis semen) bei der Bchandlung der Benignen Prostatahyperplasie, 57-79.
6. 6. Santer M: Phytochemische und andere Untersuchungen von Cucurbita pepo L., Somen mit Hinblick auf mógliche prosta-tropwirksame Inhaltstoffe Dissertation F. Univ Berlin. 1984.
7. 7. Schilcher H: Phytophaimaka zur Therapie von Prostataer-krankungen. Z Angew Phytother 1981; 2; 14-16.
8. 8. Schilcher H, Dunzenclorler U, Ascali F: Delta 7 sterole das prosiatatrope Wirkprinzinp in Kurbissamen. Urologie 1987; 27; 316-19.
9. 9. Schilcher H: Phyloterapie in der Urologie. Hippocrates Stut-tgard 1981; 84-88.
10. 10. Loy V, Hubotter R, Bauer HW: Die Entzundungen, ein Wachxlumreiz der benignen Hyperplasie der prostata, wg Bauer H. W. Brenigne Prostathyperplasie Zuckschncrcd. Miinchen 1988; 3-12.
11. 11. Reuter H: Therapie mit Phytophaimaka, Gustav Fischer Verlag. Stuttgard 1977; 152-158.
12. 12. Rhodes L, Primka RL, Berman C, Vergult G, Gabriel M, Pierre-Mallace M, Gibelin B; Comparison offinasterid (Pro-sear) a 5a reductase inhibitor and various commercial plant extracts in vitro and in vivo 5a reductase inhibitor!. Prostate 1993; 22; 43-51.
13. 13. Schulz V, Hansel R: Rationale Phyloterapie Ralgeber fur die drztiche Praxis. Springer Verlag 1995.
14. 14. Krotkiewski M: Pizeciwnowolworowe działanie alkiloglicero-li. Terapia 2001; 3; 23-24.
15. 15. Snyder F. Wood R: Alky! and alk-1-enyi ethers of glycerol in lipids from normal and neoplastic human tissues. Cancer Res 1969; 21; 241-257.
16. 16. Brohult A, Brohult J, Brohult S: Regression of tumor growth after administration of alkoxyglycerols. Acta Obst Gynecol Scan 1978; 57; 79-83.
17. 17. Skopińska-Różewska E, Krotkiewski M, Sommer E, Rogala E, Filewska M, Bialas-Chromiec B, Pastewka K, Skurzak H: Inhibitory effect of shark liver oil on cutaneous angiogene-sis induced in Balb/c mice by syngenic sarcoma L-l, human urinaiy bladder and human kidney tumour cells. Oncol Rep 1999; 6; 1341-1344.
18. 18. Sommer E, Krotkiewski M, Langlort R, Skopińska-Różewska E: Wpływ oleju z wątroby rekina na odczyn skórnej an-giogenezy indukowanej u myszy komórkami ludzkiego raka płuca. Terapia 2001; 9; 7-8.
19. 19. Sommer E, Skopińska-Różewska E, Filewska M, Kupis W. Bogdan J, Seweryniak W, Rudziński P, Caban M, Dorosz W. Gątarek J, Usiekniewicz J, Sawicka E, Bartosik W, Langforl R, Słodkowska J: Pobudzający wpływ oleju z nasion wiesiołka dziwnego (Oenothera paradoxa) na reakcje skórnej angio-genezy indukowaną u myszy komórkami ludzkich raków płuc w: Wpływ ksenobiotyków na układ odpornościowy, red. A. K. Siwicki. IRS, Olsztyn 1997; 153-158.
20. 20. Sidky Y, Auerbach R: Lymphocyte-induced angiogenesis: a quantitative and sensitive assay of the graft-versus-host reaction. J Exp Med 1975; 141; 1084-1089.
21. 21. Skopińska-Różewska E, Janik P, Przybyszewska M, Sommer E, Bialas-Chromiec B: Inhibitoiy effect of theobromine on induction of angiogenesis and VEGF mRNA expression in v-raf transfectants of human urothelial cells HCV-29. Int J Mol Med 1998; 2; 649-652.
22. 22. Snitkowska E, Domański J, Balan B, Sommer E, Skopińska-Różewska E: Program komputerowej analizy obrazów Mouse Observer i jego zastosowanie do oceny wyników uzyskanych w teście skórnej angiogenezy u myszy. Terapia 2001; 9; 9-10.
23. 23. Chorostowska-Wynimko J, Skopińska-Różewska E, Krotkiewski M, Radomska-Lesniewska D: Wpływ podawania myszom pałeczek kwasu mlekowego i oleju z wątroby rekina na aktywność chemokinetyczną ich splenocytów w hodowli in vitro. Terapia 2001; 9; 29-32
24. 24. Chorostowska-Wynmko J, Krotkiewski M, Radomska-Lesniewska D, Sokolnicka I, Skopińska-Różewska E: The synergistic effect of lactic acid bacteria and alkyloglycerols on humoral immunity in mice. Int J Tissue React 2001; 3; 81-87.
25. 25. Jackson JK, Burl HM, Oktaba AM, Hunter W, Scheid MP, Mouhajir F, Lauener RW, Shen Y, Salari H, Duronino V: The antineoplastic ether lipids-phosphonate, selectively induces apoptosis in human leukemic cells and exhibits antiangio-genic and apoptotic activity on chorioallantoic membrane of the chick embiyo. Cancer Chemother. Pharmacol. 1988; 41; 326-32.
26. 26. Mollonedo F; Selective induction of apoptosis in cancer cells by the ether lipid ET-18-OCH3 (Edelfosine).: Molecular structure requirements, cellular uptake, and protection by bcl-2 and bcl-xl. Cancer Res 1997; 57; 1320-8.
27. 27. Civoli F. Daniel L: Quarternaiy ammonium analogs of ether lipids inhibit the activation of protein kinase C and the growth of human leukemia cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol 1998; 42; 319-26.

Ewa Skopińska-Różewska
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii
Instytutu Gruźlicy i Chrób Plac
ul. Placka 26
01-138 Warszawa
tel. (0-22) 43 12 158