PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

STĘŻENIE MIEDZI I CYNKU ORAZ WSPÓŁCZYNNIK Cu/Zn W SUROWICY KRWI ORAZ TKANCE RAKA JASNOKOMÓRKOWEGO NERKI
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 2000/53/1.

autorzy

Zygmunt Dobrowolski 1, Tomasz Drewniak 1, T. Cichocki 2, Wojciech Kwiatek 3
1 Katedra i Klinika Urologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego
Kierownik: dr hab. med. Z. Dobrowolski
2 Katedra Histologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego
Kierownik: prof. dr hab. med. T. Cichocki
3 Instytut Fizyki Jądrowej im. H. Niewodniczańskiego w Krakowie
Kierownik: dr hab. Z. Stachura

słowa kluczowe

nerka rak nerki karcinogeneza miedź i cynk

streszczenie

Wstęp. W pracy podjęto próbę oceny zmiany zawartości miedzi i cynku w
tkance raka jasnokomórkowego nerki oraz w surowicy krwi, a więc pierwiast-
ków śladowych odgrywających istotną rolę w funkcjach życiowych i proce-
sach metabolicznych.
Materiał i metoda. Poziom miedzi i cynku mierzono w surowicy krwi i prób-
kach tkanek nerki u 36 chorych na raka jasnokomórkowego nerki posługując
się fizyczną metodą analizy wielopierwiastkowej $RIXE (Synchrotron Radia-
tion Induced X-ray Emission). Grupę kontrolną stanowiły wycinki tkanki kory
nerki zdrowej uzyskanej w czasie autopsji od 15 zmarłych z powodu urazu,
oraz surowica krwi od 8 krwiodawców.
Wyniki. Chorzy na raka jasnokomórkowego nerki wykazali znamienny wzrost
poziomu miedzi w surowicy oraz współczynnika proporcji miedzi do cynku,
któremu towarzyszył wzrost zaawansowania klinicznego choroby nowotworo-
wej. Obserwowano niższy poziom miedzi i cynku w tkance raka jasnokomórko-
wego nerki. Nie stwierdzono znamiennych różnic wartości współczynnika pro-
porcji miedzi do cynku w zależności od stopnia zaawansowania miejscowego i
stopnia anaplazji komórek guza. W tkance guza nerki wzrostowi stężenia po-
ziomu miedzi odpowiadał wzrost stężenia cynku. Stężenie cynku w tkance guza
było znamiennie wyższe w guzach T4 w porównaniu z guzami T2. Nie stwier-
dzono korelacji pomiędzy zawartością miedzi, cynku oraz współczynnikami Cu/
Zn w surowicy krwi i tkance raka jasnokomórkowego nerki.
Wnioski. U chorych na raka nerki obserwuje sięnieprawidłowy metabolizm
miedzi i cynku, ale ustalenie przyczyn i znaczenietegozjawiska wymaga
dalszych badań.

WSTĘP
Wiadomo że niektóre pierwiastki śladowe odgrywają szczególnie istot-
ną rolę w wielu funkcjach życiowych i procesach metabolicznych. Miedź
spełnia rolę kluczowego pierwiastka śladowego, którego metabolizm jest
precyzyjnie kontrolowany. Białka zawierające miedź biorą udział w trans-
porcie tlenu, elektronów, katalizują reakcje utleniania i redukcji [19, 26].
Jednak w nadmiarze miedź może przyczynić się do zwiększenia częstości
mutacji DNA [1, 2]. Jony miedzi biorą udział w tworzeniu związków tle-
nu o dużej aktywności chemicznej, tzw. wolne rodniki tlenowe powodu-
jące uszkodzenia biologiczne w komórce [1, 2, 24, 26-28]. W ostatnich la-
tach wykazano karcinogenność miedzi na modelu zwierzęcym nerki [29].
Cynk także spełnia kluczową rolę w wielu podstawowych procesach
metabolicznych, takich jak synteza białka, metabolizm DNA i RNA, me-
tabolizm cukrów, lipidów i innych. Pierwiastek ten jest aktywatorem
enzymów i uczestniczy w utrzymaniu prawidłowej funkcji błon komór-
kowych w organizmie [19, 20]. Cynk jest zaliczany do metali o działaniu
antynowotworowym, a jednocześnie podany do jąder gryzoni powodu-
je powstanie lokalnych guzów [3, 20, 26]. Brak jest danych epidemiolo-
gicznych dotyczących karcinogenności cynku u ludzi.
Zmiany stężenia miedzi i cynku w chorobie nowotworowej były przed-
miotem wielu badań. Wysoki poziom miedzi w osoczu stwierdzono w
nowotworach, takich jak np. białaczka, choroba Hodgkina, złośliwe chło-
niaki [23], mięsaki [5, 12], raki płuc [7, 15] i nowotwory przewodu po-
karmowego [16]. Dodatkowo wykryto dużą użyteczność kliniczną ba-
dania współczynnika stężenia miedzi w stosunku do cynku w surowicy
krwi, stosowanego do kontroli przebiegu choroby nowotworowej oraz
jako czynnika prognostycznego [6,13, 21, 25].
Obecnie nie znamy mechanizmu zmiany stężenia miedzi i cynku w
surowicy krwi w chorobie nowotworowej, ani czy jest to zjawisko pier-
wotne czy wtórne.
W prezentowanej pracy podjęto próbę oceny zmiany zawartości mie-
dzi i cynku w tkance raka jasnokomórkowego nerki oraz w surowicy
krwi. W chwili obecnej brak jest jednoznacznej opinii w kwestii wartości
i przydatności klinicznej markera nowotoworowego (substancja produ-
kowana przez guz) do oceny efektów leczenia tej choroby [4, 22].
MATERIAŁ I METODA
Praca ta obejmuje grupę 36 pacjentów z potwierdzonym badaniem
histologicznym rakiem jasnokomórkowym nerki, którzy byli leczeni
operacyjnie w Klinice Urologii CMUJ w Krakowie w latach 1993-1996.
U wszystkich pacjentów wykonano radykalne usunięcie nerki zajętej
Krew do analizy stężenia pierwiastków pobrano przed zabiegiem ope-
racyjnym od 15 chorych. Grupę kontrolną stanowiła surowica od 8 krwio-
dawców. Średni wiek grupy badanej wynosił 56 lat, a kontrolnej 35.
Liczebność grup chorych podzielono wg stopnia zaawansowania T
(tabela 2a) i stopnia złośliwości (tabela 2b) w grupie badanej (surowica
krwi).
przez guz. Z usuniętych nerek pobrano wycinki tkankowe z części no-
wotworowej oraz wycinek z nie zmienionej makroskopowo korowej czę-
ści tkanki nerkowej. Materiał tkankowy był weryfikowany histopatolo-
gicznie. Grupę kontrolną stanowiły wycinki tkanki kory nerki zdrowej
uzyskanej w czasie autopsji od 15 osób zmarłych z powodu urazu. Śred-
ni wiek badanej grupy wynosił 52 lata, a grupy kontrolnej 37 lat.
Wycinki tkankowe suszono w temperaturze 50° C przez 18 godzin na
szkiełku w suchym powietrzu, następnie próbkę homogenizowano w
moździerzu agatowym.
Z suchej masy tkanki, w prasie stalowej wykonano pastylki o średnicy
10 mm i grubości 1 mm do analizy pierwiastkowej metodą SRIXE. Pa-
stylki naklejono na taśmę Scotch i umocowano na stanowisku pomiaro-
wym w komorze próżniowej.
Badaną surowicę umieszczano na podkładce z polimeru formwaro-
wego 0,5% za pomocą pipety jednorazowej. Następnie suszono w kase-
cie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej do czasu ekspozycji
na wiązce pomiarowej. Tak prosta preparatyka umożliwia maksymalne
uniknięcie zanieczyszczenia badanej próbki. Zawartość miedzi i cynku
w surowicy krwi i próbkach tkanek był mierzony za pomocą fizycznej
metody analizy wielopierwiastkowej SRIXE (Synchrotron Radiation Indu-
ced X-ray Emission), pozwalającej wykryć pierwiastki w stężeniu około
10 ppb (partes per billion) [18]. Badania wykonano na synchrotronie NSLS
(National Synchrotron Light Source) w Brookhaven National Laboratory
na Long Island w USA.
Metoda ta jest bardzo atrakcyjna z uwagi na:
1.bardzo krótki czas analiz (10-20 sek),
2.nie niszczący materiału charakter analizy,
3.możliwość analizy w mikroobszarach (5 (im2),
4.możliwość jednoczesnej analizy wielopierwiastkowej,
5.bardzo dobrą wykrywalność, nawet poniżej 10 ppb.
Analizę statystyczną otrzymanych wyników dokonano testami nie-
parametrycznymi. Przy porównywaniu grup badanej z kontrolną zasto-
sowano test Kruskal-Wallisa. Analizując zmiany w badaniach zależnych,
czyli między korą nerki nowotworowej nie zmienionej nowotworowo a
tkanką raka jasnokomórkowego nerki stosowano test Friedmana esty-
mowany ?2 i test McNemary [8, 9].
WYNIKI
Chorzy na raka jasnokomórkowego nerki mieli znamiennie wyższe
stężenie miedzi w surowicy krwi niż grupa kontrolna, natomiast stęże-
nie cynku nie różniło się znamiennie statystycznie w obu porównywa-
nych grupach.
Wykres 1 przedstawia porównanie wartości współczynnika Cu/Zn w
badanych surowicach, w zależności od stopnia zaawansowania miejsco-
wego (T) wg skali TNM.
Wykazano wzrost wartości współczynnika Cu/Zn w surowicy wraz
ze wzrostem zaawansowania miejscowego guza.
Wykres 2 obrazuje zależność stopnia złośliwości komórek guza i war-
tości współczynnika Cu/Zn w surowicy krwi.
Wartości współczynnika Cu/Zn w surowicy grupy badanej wzrastała
wraz ze wzrostem stopnia złośliwości. W naszym materiale zjawisko po-
wyższe nie miało cech znamienności statystycznej.
Oznaczono także stężenia miedzi i cynku w tkance raka jasnokomór-
kowego nerki oraz korze nerki zdrowej. Dodatkowo oznaczono stężenia
tych pierwiastków w korze nerki nowotoworowej nie zmienionej no-
wotoworowo.
Wykres 3 przedstawia porównanie wartości średnich stężeń miedzi w
badanych tkankach nerki wraz z oceną statystyczną.
Największą zawartość miedzi stwierdzono w korze nie zmienionej
nowotoworowo nerki, najmniejszą zawartość miedzi stwierdzono w tkan-
ce raka jasnokomórkowego. Zawartość miedzi w tkance raka jasnoko-
mórkowego była około dwa razy mniejsza niż w korze grupy kontrolnej
oraz 2,5 razy mniejsza niż w korze nerki zmienionej nowotoworowo.
Wykres 4 przedstawia porównanie wartości średnich stężeń cynku w
badanych tkankach nerki wraz z oceną statystyczną.
Zawartość cynku była najmniejsza w tkance raka jasnokomórkowego.
Stężenie cynku w korze grupy kontrolnej i w korze nerki nowotoworo-
wej było podobne. Rak jasnokomórkowy nerki miał najniższe stężenie
miedzi i cynku spośród wszystkich porównywanych tkanek.
W tabeli 4 i 5 wykazano tendencję wzrostu poziomu tkankowego mie-
dzi i cynku w raku nerki wraz z postępem zaawansowania miejscowego
wg T w skali TNM oraz stopniem analpazji komórek raka jasnokomór-
kowego nerki. Znamienny statystycznie wzrost poziomu cynku w raku
nerki stwierdzono jedynie między stopniem T2 a T4.
Oceniono także zachodzące zmiany współczynnika Cu/Zn w tkance
guza w zależności od T (wg skali TNM) oraz stopnia złośliwości komó-
rek raka.
Wykres 5 przedstawia wyniki analizy wartości współczynnika Cu/Zn
w badanych tkankach nerki, zależnych od stopnia zaawansowania miej-
scowego guza nerki. W analizie tej nie wykazano znamiennych statystycz-
nie różnic pomiędzy grupami T. Stwierdzono jedynie tendencję wzrosto-
wą wraz z większym zaawansowaniem miejscowym.

Wykres 5. Współczynnik Cu/Zn w badanych tkankach nerki
a zaawansowanie kliniczne guza T wg skali TNM
Na wykresie 6 przedstawiono wartość współczynnika Cu/Zn w tkan-
ce raka jasnokomórkowego nerki i kory nerki nowotoworowej i jej zależ-
ności od stopnia złośliwości komórkowej. Nie wykazano znamiennych
różnic w badanych grupach, a jedynie tendencję wzrostową wraz ze
zwiększającym się stopniem anaplazji komórek guza.
Ostatnia analiza statystyczna obejmowała próbę oceny korelacji stęże-
nia miedzi i cynku w surowicy i tkance guza oraz kory nerki nowotowo-
rowej w badanej grupie chorych.
Stężenie miedzi w surowicy krwi korelowało wprost proporcjonalnie
zarówno do poziomu miedzi, jak i cynku w korze nerki nowotoworo-
wej. Nie stwierdzono korelacji poziomu cynku i miedzi w surowicy i w
tkance guza nerki.
DYSKUSJA
Przedstawione wyniki badań analizujące poziom miedzi i cynku u
chorych na raka jaskomórkowego nerki zostały opracowane na najwięk-
szej liczebnie grupie chorych opisanej w piśmiennictwie.
W tabeli 7 przedstawiono zbiorczo średnie zawartości tkankowe pier-
wiastków wraz z odchyleniem standardowym, opracowane na podsta-
wie doniesień w piśmiennictwie. Wartości stężeń podano w ng/g suchej
masy tkankowej (ppm). Jedynie Margalioth w swej pracy [21] podaje wy-
niki w u.g/g zawiesiny komórek guza nerki. We wszystkich opracowa-
niach tkankową grupą kontrolna była kora zdrowej nerki autopsyjnej. Au-
torzy zastosowali różne metody pomiarowe. W dwóch przypadkach
stężenia pierwiastków mierzono w spektrofotometrze absorpcyjnym (ASS – Atomie Absorbtion Spectophotometr). Pozostali zastosowali PIXE – (Pro-
ton Induced X-ray Emission), EDXRF (Energy-dispersive X-ray fluorescence)
oraz SRIXE (Synchrotron Radiation Induced X-ray Emission).
Wszyscy autorzy stwierdzili znamienne obniżenie stężenia miedzi i
cynku w tkance raka jasnokomórkowego nerki, przy czym spadek po-
ziomu cynku był większy. Powoduje to wzrost wartości Cu/Zn w guzie
nerki. Przyczyną tego zjawiska może być oddzielenie komórek nowoto-
worowych od przesączu kłębuszkowego – źródła mikroelementów do-
starfezanych do komórek kanalików nefronu [11].
W badanej grupie chorzy na raka jasnokomórkowego nerki wykazali
znamienny wzrost stężenia miedzi w surowicy oraz współczynnika pro-
porcji miedzi do cynku, któremu towarzyszył wzrost zaawansowania
klinicznego choroby nowotworowej. Obserwowano niższy poziom mie-
dzi i cynku w tkance raka jasnokomórkowego nerki. Nie stwierdzono
znamiennych różnic wartości współczynnika proporcji miedzi do cynku
w zależności od stopnia zaawansowania miejscowego guza i stopnia zło-
śliwości. W tkance guza nerki wraz z zaawansowaniem choroby wzra-
stał poziom miedzi i cynku. Stężenie cynku w tkance guza było zna-
miennie wyższe w guzach T4 w porównaniu z guzami T2. Nie stwierdzono
korelacji między zawartością miedzi, cynku oraz współczynnikami Cu/
Zn w surowicy krwi i tkance raka jasnokomórkowego nerki.
W badaniach pierwiastków śladowych trudno jest określić prawidło-
we stężenie pierwiastka w ludzkiej tkance. Różnice wynikają z dużej
zmienności zawartości tych pierwiastków u ludzi, i zależą od wieku,
diety, stanu hormonalnego i czynników środowiskowych [10, 21]. Do-
datkowo porównanie utrudnia stosowanie różnych preparatów do pró-
bek biologicznych oraz różnic w metodach pomiarowych [11,14,17,21].
Tkanka guza w doniesieniach naukowych wykazywała obniżenie za-
równo miedzi, jak i cynku, z różnym poziomem istotności.
Rola, jaką odgrywają mikroelementy w karcinogenezie u ludzi, a
szczególnie pierwiastki niezbędne dla człowieka, nie jest znana. Na
modelach zwierzęcych miedź wywołuje guzy złośliwe nerki [20, 29], a
cynk guzy jąder [3]. W badaniach in vitro i na liniach komórkowych
dodanie miedzi do hodowli powoduje wzrost częstości uszkodzeń DNA
komórek [1, 26-28], a cynk, paradoksalnie, ma uznaną funkcję anty-
karcinogenną [2,10,19].
Znalezienie wzajemnych relacji między nowotworem a pierwiastka-
mi śladowymi, a następnie ocena ich przydatności w wykrywaniu cho-
roby nowotoworowej, ocenie przebiegu i rokowaniu wydaje się dobrym
kierunkiem dalszych badań. Trudno jest ocenić czy obserwowane zmia-
ny stężeń miedzi i cynku są pierwotne, czy wynikają ze zmiany metabo-
lizmu w chorobie nowotoworowej. Nasza praca jest próbą rzucenia świa-
tła na ten problem.
WNIOSKI
1.Chorzy na raka jasnokomórkowego nerki wykazali znamienny
wzrost stężenia miedzi w surowicy oraz współczynnika proporcji mie-
dzi do cynku, czemu towarzyszył wzrost zaawansowania klinicznego
choroby nowotworowej.
2.Obserwowano obniżoną zawartość miedzi i cynku w tkance raka
jasnokomórkowego nerki.
3.Nie stwierdzono znamiennych różnic wartości współczynnika pro-
porcji miedzi do cynku w zależności od stopnia zaawansowania miej-
scowego i stopnia złośliwości komórek guza.
4.W tkance guza nerki wzrostowi stężenia miedzi odpowiadał wzrost
stężenia cynku.
5.Stężenie cynku w tkance guza było znamiennie wyższe w guzach T4
w porównaniu z guzami T2.
6.Nie stwierdzono korelacji między zawartością miedzi, cynku oraz
współczynnikami Cu/Zn w surowicy krwi i tkance raka jasnokomórko-
wego nerki.

piśmiennictwo

  1. [1] Aruoma, O. I., Halliwell, B., Gajewski, E., Dizaroglu, M.: Copper-ion
  2. dependent damage to the bases in DNA in presence of hydrogen peroiide. Biochem.
  3. J. 1991, 273, 601-604.
  4. [2] Bartosz, G.: Druga twarz tlenu. PWN, 1995.
  5. [3] Boffetta, P.: Carcinogenicity of tracę elernents with reference to evaluations made
  6. by the International Agency for Research on Cancer. Scand. J. Work Environ.
  7. Health. 1993,19, 67-70.
  8. [4] Bono, A. V., Lovisolo, J. A.: Renal cell carcinoma - diagnosis and treatment:
  9. state of art. Eur. Urol. 1997, 31, 47-55.
  10. [5] Breiter, D. N.: Serum copper and zinc measurements in patients with osteogenic
  11. Sarcoma. Cancer 1978, 42, 598-602.
  12. [6] Cavallo, R, Gerber, M., Marubini, E., Richardson, S., Barbieri, A.,
  13. Costa, A., DeCarli, A., Pujol, H.: Zinc and copper in breast cancer. A joint
  14. study in northern Italy and southern France. Cancer 1991, 67, 738-745.
  15. [7] Diez, M., Arroyo, M., Cerdan, F. J., Munoz, M., Martin, M. A.,
  16. Balibrea, J. L.: Serum and tissue tracę metal levels in lung cancer. Oncology 1989,
  17. 46, 230-234.
  18. [8] Domański, C: Statystyczne testy nieparametryczne. PWE, Warszawa 1996.
  19. [9] Domański, C: Testy statystyczne. PWE, Warszawa, 1990.
  20. [10] Drakę, E. N., Sky Peck, H. H.: Discriminant analysis of tracę element distri-
  21. bution in normal and malignant human tissues. Cancer Res. 1989,49,4210-4215.
  22. [11] Fassina, A. S., Calliari I., Sangiorgio, A., Rossato, M., Ramigni, M.,
  23. Dal Bianco, M., Pagano, F.: Quantitative analysis of tracę elernents in human
  24. clear cell carcinoma of the kidney by energy-dispersive X-ray fluorescence. Eur. Urol.
  25. 1990,18,140-144.
  26. [12] Fischer, G. L. et al.: Copper and zinc levels in serum from human patients with
  27. sarcomas. Cancer 1976, 37, 356-363.
  28. [13] Gupta, S. K., Shukla, V. K., Vaidya, M. R, Roy, S. K.: Serum tracę elernents
  29. and Cu/Zn ratio in breast cancer patients. J. Surg. Oncol. 1991,46,178-181.
  30. [14] Hardell, L., Wing, A. M., Ljungberg, B., Dreifaldt, A. C, Degerman,
  31. A., Halmans, G.: Levels ofcadmium, zinc and copper in renal cell carcinoma and
  32. normal kidney. Eur. J. Cancer. Prev. 1994, 3, 45-48.
  33. [15] Huhti, Z.: Serum copper levels in patients with lung cancer. Respiration 1980,
  34. 40,112-116.
  35. [16] Inutsuka, S.: Plasma copper and zinc levels in patients with malignant tumours
  36. ofdigestive organs. Cancer 1978, 42, 626-661.
  37. [17] Karcioglu, Z. A., Sarper, R. M., Van Rinsvelt, H. A., Guffey, J. A., Fink,
  38. R. W.: Trace element concentrations in renal cell carcinoma. Cancer 1978,42,1330-
  39. 1340.
  40. [18] Kwiatek, W. M.: Bio-medical application of synchrotron radiation X-ray
  41. fluorescence. Acta Phisica Polonica 1994, 86, 695-703.
  42. [19] Madej, A. J.: Etiologia i patogeneza nowotworów. Alpha-medica Press 1996,
  43. 44-46.
  44. [20] Magos, L.: Epidemiological and experimental aspects of metal carcinogenesis.
  45. Environ. Health, Perspect 1991, 95,157-189.
  46. [21] Margalioth, E. J., Schenker, J. G., Cherion, M.: Copper and zinc levels in
  47. normal and malignant tissue. Cancer 1983, 52, 868-872.
  48. [22] Newling, D. W.: Renal cell carcinoma. Eur. Urol. Update 1996, 5, 73-78.
  49. [23] Pizzolo, G., Savarin, T.: The diagnostic value of serum copper levels and other
  50. hematochemical parameters in malignancies. Tumori 1978, 64, 55-61.
  51. [24] Prutz, W. A., Butler, ]., Lamd, E. J.: łnteraction of copper (I) with nucleic
  52. acid. Int. J. Rad. Biol. 1990, 58, 215-234.
  53. [25] Rodriguez Mendez, M. L.: Usefulness of serum copper, zinc, selenium and other
  54. trace element levels as biochemical inorganic markers. Spain Diss. Abstr. 1992,53,
  55. 733.
  56. [26] Rose, J.: Trace elernents in health. Ed., Butterworth Co. Ltd. London 1983.
  57. [27] Sagripanti, J. L., Georing, P. L., Lamanna, A.: łnteraction of copper with
  58. DNA and antagonism by other metals. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1991,110,477-
  59. 485.
  60. [28] Tkeshelasłwili, L. K., McBridge, T., Spence, K., Leob, L. A.: Mutation
  61. Spectrum of copper induced DNA damage. J. Biol. Chem. 1991, 266, 6401-6406.
  62. [29] Toyokuni, S., Tanaka, T., Nishiyama, Y., Okamoto, K., Nakashima, Y.,
  63. Hamazaki, S., Okada, S., Hiai, H.: Induction of renal cell carcinoma in male
  64. Wistar rats treated with cupric nitrilotriacetate. Lab. Invest. 1996, 75, 239-248.