english version wersja do druku
	kwartalnik ISSN 0500-7208 Czasopismo punktowane przez KBN, Index Copernicus oraz w bazie GBL

Wprowadzenie

Rozwój raka pęcherza moczowego związany jest z wpływem wielu czynników genetycznych i środowiskowych. Jednym z najistotniejszych jest palenie papierosów zwiększające czterokrotnie ryzyko wystąpienia schorzenia. Spośród wielu czynników genetycznych, związanych z rakiem pęcherza moczowego, kluczową rolę odgrywają zmiany wpływające na oddziaływanie pomiędzy komórkami nowotworowymi a otaczającym je środowiskiem tkankowym (microenvironment).

Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP) to rodzina enzymów kluczowych dla utrzymania stałości mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego. Enzymy te pełnią różnorakie funkcje biologiczne, m. in: uwalnianie do środowiska mediatorów (cytokin), receptorów błonowych, uczestniczą w angiogenezie, w inwazji komórek nowotworowych oraz rozwoju raka. Wykazano że MMP-1, -2, -3, -9 biorą także udział w progresji raka pęcherza moczowego, a stopień ich ekspresji pozwala na ocenę stopnia zaawansowania nowotworu (T, G) oraz dalszego przebiegu choroby.

Autorzy poddali analizie polimorfizm pojedynczych nukleotydów (SNP), występujący w obrębie promotorów genów o udowodnionym wpływie na ekspresję MMP i związku z różnymi nowotworami: MMP-1-1607 i MMP-1-1612 w przypadku raka okrężnicy oraz MMP-2-1306 i MMP-9-1562 w przypadku raka sutka. W przypadkach polimorfizmu mikrosatelitarnego promotora genu MMP-9 oraz polimorfizmu pojedynczych nukleotydów MMP-12-82 udowodniono ich wpływ na zmianę ekspresji genów, ale nie wykazano związku z ryzykiem rozwoju nowotworów. Dodatkowo do badań wybrano sześć innych przykładów SNP genów metaloproteinaz (MMP-3: E45K, MMP-8: K87E, MMP-9: A2V, R279Q, P574R), które powodują zmiany w składzie aminokwasów łańcuchów białkowych badanych enzymów i tym samym zmianę ich funkcji.

Ponieważ rozwój raka pęcherza moczowego wiąże się z kompleksem zaburzeń genetycznych, to pojedyncze przypadki SNP wydają się mieć umiarkowany wpływ na schorzenie. Jednak analiza kilku zdarzeń genetycznych w obrębie istotnych szlaków metabolicznych może ujawnić grupy pacjentów z istotnie zwiększonym ryzykiem rozwoju choroby. Badaniu poddano wystąpienie jedenastu SNP i jednego przypadku powtórzeń mikrosatelitarnych w obrębie sześciu genów MMP oraz ich związek z ryzykiem rozwoju postaci powierzchownej oraz naciekającej raka pęcherza moczowego.

Materiał i metoda

Analizie poddano 737 chorych (przedstawicieli rasy białej) z nowo rozpoznanym rakiem pęcherza moczowego leczonych w okresie od 1999 do 2004 roku oraz 656 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Dane genetyczne uzyskano ostatecznie od 560 pacjentów i 560 zdrowych. Pacjenci nie byli poddani chemio- oraz radioterapii.

Badanym pobierano 40 ml krwi obwodowej i uzyskiwano informacje dotyczące palenia tytoniu. Palaczami określono osoby, które wypaliły przynajmniej 100 papierosów w życiu, w tym jako byłych palaczy te osoby, które zarzuciły nałóg przynajmniej rok przed rozpoznaniem choroby lub przed włączeniem do badania. Liczbę wypalanych papierosów określano w postaci zużywanych opakowań na rok (pack-years: dzienna liczba papierosów dzielona przez 20 i pomnożona przez liczbę lat palenia). Jako zaawansowanych palaczy określono osoby z powyżej 31 ?pack-years? a niezaawansowanych (light smokers) ? poniżej 31.

Przypadki raka pęcherza grupowano jako pierwotnie powierzchowne lub naciekające.

Materiał genetyczny izolowano z krwi obwodowej. Polimorfizm oceniano metodą PCR lub PCR-RFLP.

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu testu c2 Pearsonsa i testu Wilcoxona. Za pomocą wieloczynnikowej analizy regresji określono ryzyko wystąpienia zdarzenia (OR -odds ratio) oraz przedział ufności (CI ? confidence interval 95%).

Wyniki

Ostatecznie uzyskano dane genetyczne od 560 pacjentów oraz zdrowych osób z grupy kontrolnej. Pomiędzy grupami nie było istotnych różnic wieku. Średni wiek pacjentów wyniósł 65 lat, a grupy kontrolnej 64 lata. 43% pacjentów i 21% osób z grupy kontrolnej określono jako zaawansowanych palaczy (>31 pack-years). 45% osób z grupy kontrolnej i 26% z grupy badanej nigdy nie paliło papierosów. 44% przypadków raka stanowiła postać pierwotnie naciekająca, a 56% powierzchowna.

Stwierdzono statystycznie znacząco zwiększone ryzyko raka pierwotnie naciekającego u chorych z powyżej 24 repetycjami CA w regionie promotora genu MMP-9 (OR 2,6; 95% CI 1,07-6,26). U pacjentów, u których stwierdzono polimorfizm genu MMP w układzie MMP -12-82 SNP (genotyp GG) ryzyko wystąpienia pierwotnie naciekającego raka pęcherza moczowego było 4,59 razy większe. Nie stwierdzono związku pomiędzy poszczególnymi loci MMP a ryzykiem wystąpienia postaci powierzchownej.

Znaczącą redukcję ryzyka rozwoju raka pęcherza stwierdzono u niezaawansowanych palaczy z SNP w postaci MMP-9-1562 (CT) SNP i MMP-9-R668Q (AG). U palaczy będących homozygotami w stosunku do allele 1G genu z polimorfizmem MMP-1-1607 stwierdzono podwyższone ryzyko wystąpienia postaci pierwotnie naciekającej. U osób nigdy nie palących z allelem A genotypu MMP-8 K87E ryzyko wystąpienia postaci pierwotnie naciekającej było podwyższone 2,58 x.

Z kolei wykazano, że ekspresja allele T genotypu MMP-9-1562 wykazuje znamiennie statystyczny efekt ochronny (50%) w odniesieniu do ryzyka rozwoju pierwotnie powierzchownej postaci raka pęcherza. Pozostałe przykłady polimorfizmu SNP badanych genów MMP nie były istotne statystycznie.

Odmiany allele genów MMP grupowano pod względem liczby wariantów (I grupa: do 3 wariantów allele, II: 4-6 allele, III: powyżej 6). W grupie ?mało zaawansowanych? palaczy stwierdzono redukcję ryzyka wystąpienia postaci pierwotnie naciekającej: o 55% z 4-5 allele MMP i o 57% w przypadku powyżej 6 allele MMP.

Badane geny kodujące metaloproteinazy nie pozostawały we wzajemnym związku. Analiza haplotypu MMP-9 objęła 6 allele oznaczonych od H1 do H6 (na podstawie częstości występowania: H1 najczęstszy a H6 najrzadszy). Podwyższone ryzyko rozwoju raka pęcherza moczowego stwierdzono u osób z haplotypem H6 (OR 2,76; 95% CI 1,14-6,68).

Określono również częstość występowania diplotypii. Postacią najczęstszą był układ H1-H1. Tylko dla układu w postaci H1-H6 stwierdzono podwyższone ryzyko postaci pierwotnie naciekającej raka pęcherza moczowego. Nie wykazano wpływu układu H1-H6 na częstość występowania postaci powierzchownej. W przypadku genów MMP-1, -3, -8, -12 nie wykazano powiązania występowania układów haplo- i diplotypii z ryzykiem rozwoju raka pęcherza moczowego.

Dyskusja

Najważniejszym rezultatem przedstawionych badań jest wykazanie, że pojedyncze przypadki polimorfizmu genów MMP nie wpływają na ryzyko wystąpienia raka pęcherza moczowego. Natomiast wykazano wpływ takich zdarzeń genetycznych na częstość występowania postaci pierwotnie naciekającej. Podobny związek zanotowano dla wybranych kombinacji haplotypów i dyplotypów genu MMP-9.

Działanie metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej wiąże się ze zmianami cytokin środowiska komórkowego, tworzeniem sprzyjającego gruntu dla angiogenezy i inwazji guza. Badania wykazały podobną rolę MMP w przypadku raka pęcherza moczowego. Poziom tych enzymów w moczu oraz określana metodami immunohistochemicznymi wielkość ekspresji w tkankach wiążą się proporcjonalnie ze stopniem zaawansowania i złośliwości raka pęcherza moczowego. Co więcej, w modelach mysich wykazano, że inhibitory metaloproteinaz (np. halofunginon) ograniczają rozrost guza oraz angiogenezę.

Enzym MMP-9 odgrywa istotną rolę w rozwoju wielu nowotworów. Powoduje rozkład głównego składnika błon podstawnych, jakim jest kolagen typu IV, a przerwanie ciągłości błony podstawnej jest kluczowe dla rozwoju inwazyjności guza. Ekspresja genu MMP-9 podlega regulacji m. in. przez białka aktywujące 1 i 2 (AP1, AP2), czynniki jądrowe kB, SP-1. Polimorfizm mikrosatelitarny genu MMP-9 występuje w obrębie promotora blisko miejsca wiązania AP1. Jak wykazały wcześniejsze badania, osoby z repetycjami CA w ilości min. 24 mają dwudziestokrotnie większą ekspresję genu niż osoby z mniej niż 20 powtórzeń CA. Autorzy omawianej pracy wykazali znaczący wzrost ryzyka rozwoju inwazyjnej postaci raka pęcherza moczowego u osób z liczbą repetycji CA przekraczającą 24.

Do zmiany ekspresji metaloproteinaz przyczynia się także polimorfizm pojedynczych nukleotydów typu 82 A/G enzymu MMP-12 (MMP-12-82 A/G SNP), ponieważ jest to zmiana lokalizująca się w miejscu wiązania czynnika transkrypcyjnego AP1. MMP-12 jest metaloproteinazą o działaniu angiostatycznym, a ponieważ genotyp typu GG powoduje obniżenie ekspresji enzymu, to taka zmiana SNP przyczynia się do wzrostu ryzyka wystąpienia postaci pierwotnie inwazyjnej.

Analiza uzyskanych danych genetycznych w odniesieniu do ekspozycji na karcinogeny dymu tytoniowego wykazała paradoksalnie ochronny efekt SNP na całkowite ryzyko wystąpienia raka pęcherza moczowego oraz ryzyko rozwoju postaci pierwotnie naciekającej. Prawdopodobnie te enzymy przeciwdziałają wpływowi niewielkiej ekspozycji na karcinogeny. Ponieważ podwyższony poziom tkankowych inhibitorów metaloproteinaz wiąże się ze wzrostem inwazyjności guza pęcherza moczowego, sugeruje to protekcyjne działanie niektórych MMP poprzez utrzymanie odpowiedniej równowagi między inhibitorem i enzymem. Dopiero silna ekspozycja na karcinogen doprowadza do przełamania efektu działania tych MMP. Jednak ? jak zaznaczają autorzy pracy ? do powyższych danych należy podejść z ostrożnością ze względu na małą liczebność badanej grupy, stwarzającą ryzyko przypadkowości danych.

Dane statystycznie znaczące uzyskano dla MMP-9-1562 SNP (P 0,04 dla całkowitego ryzyka raka pęcherza i 0,005 dla ryzyka rozwoju postaci powierzchownej).

Ponieważ pojedyncze przypadki polimorfizmu mają niewielki wpływ na ryzyko rozwoju raka pęcherza moczowego, autorzy badali wpływ wielu postaci polimorfizmu MMP, prowadząc analizę haplotypów i diplotypów. Stwierdzono, że osoby z haplotypem MMP-9-H6 mają trzykrotnie większe ryzyko rozwoju raka pęcherza moczowego, a w przypadku diplotypii H1-H6 ryzyko to jest jeszcze większe, co sugeruje, że kombinacje polimorfizmów SNP zwiększają ryzyko nowotworu.

Biologiczna rola MMP w obrębie nabłonka dróg moczowych i zmiany czynnościowe zachodzące na skutek polimorfizmu pojedynczych nukleotydów nie zostały w pełni poznane. Autorzy pracy stwierdzają, że nie można w pełni określić wpływu tych zmian na ryzyko rozwoju nowotworów pęcherza moczowego. Efekt taki jednak istnieje, czego dowodzą wyniki prezentowanych badań. Wykazano m. in. ochronny wpływ pewnych kombinacji i wariantów allele w przypadku umiarkowanej ekspozycji na karcinogeny dymu tytoniowego. Wykazano także zwiększone ryzyko rozwoju raka pęcherza moczowego dla określonych układów haplotypów i diplotypów metaloproteinazy-9.

Dalsze badania prowadzone w tym kierunku pozwolą na opracowanie nowych metod oceny ryzyka wystąpienia nowotworów i poznanie biologii nowotworów.

Komentarz

Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP) są grupą enzymów biorących udział w utrzymaniu stałości środowiska zewnątrzkomórkowego (macierzy zewnątrzkomórkowej). Należą do klasy endopeptydaz zależnych od cynku powodujących rozkład białek zewnątrzkomórkowych. Biorą udział w przebudowie środowiska zewnątrzkomórkowego oraz utrzymaniu jego stałości, a wszystkie procesy, tak fizjologiczne jak i patologiczne, zachodzące w obrębie tkanek także wiążą się z ich czynnością (np. embriogeneza, angiogeneza, gojenie, zapalenie, migracja komórek guza, naciekanie podłoża, powstawanie przerzutów). Opisano 23 enzymy z rodziny metaloproteinaz. Klasyfikacja oparta na ich budowie wyróżnia sześć grup: kolagenazy, żelatynazy, stromielinazy (rozkładające m. in. fibronektynę), matrylizyny (rozkładające fibronektynę, fibrynogen, kolagen typu IV), metaloproteinazy błonowe i metaloproteinazy niesklasyfikowane

Wykazano, że tkankowa ekspresja MMP wzrasta we wszystkich typach nowotworów proporcjonalnie do ich zaawansowania i wiąże się z krótszym okresem przeżycia. Prócz tego istotną rola metaloproteinaz wykazano w wielu schorzeniach degeneracyjnych (m.in. stwardnieniu rozsianym, reumatoidalnym zapaleniu stawów, stwardnieniu zanikowym bocznym, polineuropatii demielinizacyjnej, zespole Guillaina-Barrego).

Ze względu na tak istotną rolę metaloproteinaz w relacjach komórka ? podścielisko, poznanie mechanizmu podobnych oddziaływań w przypadku raka pęcherza moczowego pozwoli na określenie nowych elementów ryzyka rozwoju tego nowotworu i opracowanie czynników prognostycznych przebiegu choroby.

dr n. med. Stanisław Wroński
Oddział Urologii Szpitala Wojewódzkiego im. dr. J. Biziela
ul. Ujejskiego 75
85-168 Bydgoszcz
wrona@ozzl.org.pl