PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

OCENA EKSPRESJI mRNA GENU MDR-1 W NOWOTWORACH ZŁOŚLIWYCH NEREK DONIESIENIE WSTĘPNE
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1997/50/4.

autorzy

Jarosław Ćwikła, Marek Żabiński 1, Sławomir Dąbrowski 2, Leszek Królicki 3
Zakład Roentgenodiagnostyki i Medycyny Nuklearnej
CMKP Warszawa, PSK nr 2 im. prof. Adama Grucy
Kierownik: lek. med. J. Szawdyn
1 Oddział Urologii
Zakład Opieki Zdrowotnej - Szpital Miejski im. Mikołaja Kopernika
10-045 Olsztyn, al. Niepodległości 44
Kierownik: lek. med. M. Żabiński
2 Katedra Mikrobiologii, Politechnika Gdańska
80-952 Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12
Kierownik: prof. dr hab. J. Kur
3 Zakład Medycyny Nuklearnej i Rezonansu Magnetycznego
Wojewódzki Zespół Publicznych Zakładów Opieki Zdrowotnej
03-242 Warszawa, Kondratowicza 8
Kierownik: prof. dr hab. L. Królicki

słowa kluczowe

nerka rak nerki pporność wielolekowa mRNA MDR-1, RT-PCR

streszczenie

Wstęp i cel pracy. Niepowodzenie chemioterapii w leczeniu guzów złośli-
wych związane jest z opornością komórek guza na stosowane leki. Z ba-
dań wynika, że raki prezentujące wzmożoną ekspresję P-glikoproteiny
Pgp
rapeutyków, między innymi na leki typu: antracykliny, alkaloidy barwinka
oraz aktynomycynę D. Pgp jest kodowana przez gen MDR-1. Fizjologicz-
nie wysoka ekspresja mRNA genu MDR-1 jest spotykana w ludzkiej nerce,
w komórkach cewek proksymalnych. Komórki te również są najczęstszym
punktem wyjścia guzów złośliwych nerki. W komórkach raka nerki często
spotyka się nadmierną ekspresję Pgp, co wiąże się z występowaniem opor-
ności na standardową chemioterapię. W poprzednich badaniach stwier-
dzono różnorodny poziom ekspresji Pgp, w zależności od stopnia zróżni-
cowania i typu histologicznego guza. Guzy, które nie mają ekspresji Pgp
mogą potencjalnie reagować na użyte leczenie cytotoksyczne. Celem ba-
dania była wstępna ocena ekspresji mRNA genu MDR-1 w guzach nerki u
badanych chorych.
Materiał i metoda. Badania przeprowadzono u 10 chorych z histopatolo-
gicznie potwierdzonym rakiem nerki. Wszyscy byli leczeni za pomocą ra-
dykalnej nefrektomii. Materiał badawczy był pobierany w trakcie zabiegu
operacyjnego, natychmiast po usunięciu zajętej nerki. Wielkość ekspresji
mRNA genu MDR-1 określono w każdym przypadku wykorzystując meto-
dę półilościową, opartą na reakcji RT-PCR (ang. reverse transcryptase ?
polymerase chain reaction).
Wyniki. W badaniach stwierdzono w 5 przypadkach obecność mRNA genu
MDR-1. W pozostałych 5 przypadkach nie stwierdzono obecności specy-
ficznego mRNA.
Wnioski. W opracowaniu zaprezentowano potencjalne wykorzystanie me-
tody RT-PCR w ocenie ekspresji mRNA genu MDR-1 u chorych na raka
nerki, u których nie stosowano leczenia chemicznego. Zaprezentowana
prosta i czuła metoda wydaje się obiecującym narzędziem w detekcji eks-
presji genu MDR-1, co może mieć znaczenie w dalszym racjonalnym uży-
ciu chemioterapii u chorych na raka nerki.

WSTĘP


Zdolność przeżycia komórek guza złośliwego po ekspozycji na różne-

go rodzaju środki chemioterapeutyczne stanowi obecnie jeden z głów- nych problemów w leczeniu nowotworów [3]. W złożonym mechanizmie oporności nowotworu złośliwego na leki jednym z podstawowym me- chanizmów jest tzw. wielolekowa oporność (MDR ? multidrug resis-tan- ce), charakteryzująca się krzyżową opornością na różnorodne leki, często nie powiązane ze sobą strukturalnie, czy funkcjonalnie. Oporność ta po- lega na zmniejszeniu zawartości leku w komórce w wyniku aktywnego transportu poprzez błonę komórkową na zewnątrz [1]. Wykorzystanie fenotypu wielolekowej oporności odbywa się między innymi za pomocą ekspresji genu MDR-1 [16,19]. Gen ten koduje błonową glikoproteinę o ciężarze 170 kD, zwaną P-glikoproteiną spełniającą rolę aktywnej pom- py. Odkrycie tego białka stworzyło podstawy do opracowania pojęcia oporności wielolekowej (ang. MDR ? multidrug resistance) [4,16].


Ekspresja genu MDR-1 jest spotykana w wielu różnych nowotworach ludzkich, zarówno tych nie leczonych, jak i tych leczonych chemiotera- peutykami. Dodatkowo ekspresję tego genu wykazano w wielu normal- nych tkankach. Największy poziom ekspresji jest obserwowany w nad- nerczach, duży w nerce. Znaczący poziom jest stwierdzany w jelicie gru- bym, w jelicie cienkim, w wątrobie oraz w płucach [4, 5].


Rak nerki stanowi około 3% wszystkich nowotworów złośliwych stwier- dzanych u dorosłych [2,3]. Radykalna nefrektomia jest leczeniem z wybo- ru. Na podstawie danych z piśmiennictwa u około 23% chorych występują przerzuty odległe w chwili diagnozy [2,3]. Obecnie prowadzone są inten- sywne prace badawcze szukające odpowiedniej specyficznej chemiotera- pii w celu poprawy skuteczności leczenia i przeżycia chorych [2, 7]. Do- datkowo szczególnego znaczenia nabierają przypadki chorych z rozsianą chorobą i/lub chorzy z masywnym nieoperacyjnym guzem. Nowotwory nerek w większości są oporne na chemioterapię. We wcze- śniejszych badaniach wykazano wzmożoną ekspresję genu MDR-1 w guzach nerek [7]. Wzmożoną ekspresję produktu genu MDR-1 oraz P- glikoproteiny (Pgp) wykazano również wykorzystując metody immuno- cytochemiczne [12,15, 20]. Analiza immunohistochemiczna Pgp w nor- malnej tkance nerkowej, z użyciem monoklonalnych przeciwciał wyka- zała, że w największej ilości białko to znajduje się na powierzchni wy- dzielniczej cewek proksymalnych [20].


Zmienione komórki nabłonkowe cewek proksymalnych są też najczęst- szym punktem wyjścia zmian nowotworowych nerek, co może sugero- wać występowanie ekspresji genu MDR-1 w tego typu nowotworach [2, 7,15,20]. Jednak, jak wykazały wcześniejsze badania, nie wszystkie guzy nerek wykazują ekspresję produktu genu MDR-1 [12,15, 20]. Celem ba- dania była ocena wielkość ekspresji mRNA genu MDR-1 w pierwotnych nowotworach złośliwych nerek u badanych chorych.


MATERIAŁ I METODA


Badanie wykonano u 10 chorych (4 kobiet i 6 mężczyzn) z potwierdzo- nym histopatologicznie rakiem nerki. Wszyscy chorzy operowani byli na Oddziale Urologii; ZOZ Szpital Miejski, Olsztyn. U wszystkich chorych wykonano przezbrzuszną radykalną nefrektomię. Kliniczne stopniowa- nie zostało przeprowadzone u wszystkich chorych na podstawie kryte- riów zaproponowanych przez Robsona [14], przez co najmniej dwóch lekarzy wyspecjalizowanych w urologii onkologicznej. Ocena patologicz- na zmian nowotworowych została dokonana na podstawie międzynaro- dowej klasyfikacji TNM [6].


Ocena histopatologiczna była wykonana w Zakładzie Anatomii Pato- logicznej Wojewódzkiego Szpitala Zespolonego w Olsztynie. Przygoto- wanie preparatów histologicznych opierało się na konwencjonalnych metodach barwienia: hematoksyliną i eozyną.


Materiał biologiczny wykorzystany w ocenie ekspresji mRNA genu MDR-1 był pobierany w trakcie zabiegu operacyjnego bezpośrednio po usunięciu nerki. Część guza po przemyciu w 0,9% roztworze NaCl w temperaturze 4°C, natychmiast zamrażana była w ciekłym azocie oraz przechowywana do czasu wykonania półilościowej analizy mRNA genu MDR-1. W badanich wykorzystano metodę RT-PCR (ang. reverse trans- cripłion polymerase chain reaction, łańcuchowa reakcja polimeryzacji DNA in vitro na matrycy uzyskanej z mRNA przy użyciu odwrotnej transkryp- tazy). Metoda ta polega na wybiórczej lub przypadkowej syntezie DNA na matrycy określonego mRNA lub totalnego mRNA, po której następuje wybiórcza amplifikacja tak syntetyzowanego DNA [8,17]. Analiza mRNA genu MDR-1 była opracowana według zmodyfikowa- nej metody opisanej przez Noonana w 1990 [13]. Izolacja mRNA była prowadzona z wykorzystaniem standardowych metod, w oparciu o ko- mercyjny zestaw diagnostyczny izolacji RNA (A&A Biotechnology; Gdańsk; Polska). cDNA na matrycy RNA było syntetyzowane przy uzz- zyciu 100 ng primerów heksadezoksynukleotydów w 10 ml roztworu za- wierającego: 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KC1, 3 mM MgCl2,10 mM dithiothreitol, po 500 mM każdego z nukleotydów dNTP i 20 jednostek wirusowej odwrotnej transkryptazy (Maloney murine leukemia virus; Pro- mega; Wl; USA). PCR wykonano na matrycy otrzymanego cDNA, wyko- rzystując 1 jednostkę Polimerazy Delta2 (DNA, Gdańsk; Polska) w koń- cowej objętości 50 ml. Sekwencja starterów użytych do amplifikacji genu referencyjnego (?2 mikroglobuliny przedstawiała się następująco, sekwen cja Miel: 51 ACCCCCACTGAAAAAGATGA (1544-1563) oraz Mic2 51 ATCTTCAAACCTCCATGATG (2253-2262). Flankowały one region zło- żony ze 120 par zasad. Dla genu MDR-1 stosowano następujące startery Mdrl 51 CCCATCATTGCAATAGCAGG (2596-2615) oraz Mdr2: 51 GTT- CAAACTTCTGCTCCTGA (2733-2752). Produktem reakcji był fragment złożony ze 157 par zasad. Produkty reakcji RT-PCR, jak i kontrole nega- tywne rozdzielano w 10% żelu poliakrylamidowym. Produkty reakcji PCR wybarwiono bromkiem ety dyny (Sigma; Niemcy). Odczyt produktów re- akcji przeprowadzono pod kontrolą światła nadfioletowego (UV), o dłu- gości fali 315 nm. Ocena ekspresji mRNA genu MDR-1 była obliczona w sposób półilościowy i przedstawiona jako proporcja, na podstawie stałej ekspresji genu referencyjnego ?2-mikroglobuliny. Analizę przeprowadzo- no na podstawie oceny densytometrycznej z wykorzystaniem zestawu BioDoc (Biometra; Goettingen; Niemcy).


STATYSTYKA


Wartość ekspresji mRNA genu MDR-1 pokazano w postaci proporcji. Pozostałe wartości podawano w procentach oraz jako wartości średnie (z uwzględnieniem odchylenia standardowego). Obliczenia wykonano posługując się programem komputerowym Excel 5.0 (Microsoft, USA). Prawdopodobieństwo p<0,05 przyjęto jako statystycznie istotne.


WYNIKI


Średnia wieku badanych chorych wyniosła 59 lat (SD 5,6 lat). Wszyst- kie guzy nerek w badaniu histologicznym były typu raka jasnokomórko- wego, włączając dwa przypadki o mieszanym utkaniu jasnokomórko- wy ? granulocytarny. W badaniu stwierdzono 9 guzów drugiego stopnia histologicznej złośliwości oraz jeden pierwszego stopnia. Na podstawie klasyfikacji Robsona stwierdzono: jeden przypadek guza w stopniu pierw- szym, 4 przypadki w stopniu drugim, 4 przypadki w stopniu trzecim oraz pojedynczy przypadek w stopniu czwartym. Przypadek ten dotyczył cho- rej z bardzo dużym guzem, o średnicy ponad 15 cm, z zajętymi okolicz- nymi węzłami chłonnymi oraz przerzutami odległymi do płuc. Średni wymiar wszystkich guzów wynosił 6,99 cm (SD 3,5 cm). W badaniu ekspresji genu MDR-1 stwierdzono w 5 przypadkach obec- ność specyficznego mRNA. Średnia ilość mRNA MDR-1 obliczona za po- mocą proporcji z wykorzystaniem mRNA (?2-mikroglobuliny jako genu referencyjnego o stałej ekspresji, wyniosła 0,095 (rozpiętość wyników była od 0 do 0,33, SD 0,1). W grupie pięciu chorych z ekspresją genu MDR-1 średnia wielkość proporcji wyniosła 0,17 (SD 0,1). Nie znaleziono istotnych różnic pomiędzy wiekiem chorych jak rów- nież wymiarem guza, u chorych ze stwierdzoną ekspresją mRNA genu MDR-1 oraz u chorych bez ekspresji.


Zestawione dane wszystkich chorych oraz wyniki analizy półilościo- wej mRNA genu MDR-1 są przedstawione w tabeli I. Uwzględniono na- stępujące elementy: wiek chorych (lata), wymiar guza (określony jako największa średnica guza w cm), typ histopatologiczny, stopień histolo- gicznej złośliwości, klasyfikację na podstawie opracowania Robsona i skali TNM (T) oraz poziom ekspresji mRNA genu MDR-1 u wszystkich cho- rych. W tabeli II porównano wiek chorych (lata) oraz wymiar guza (cm) w grupie chorych ze stwierdzoną ekspresją oraz z brakiem ekspresji mRNA genu MDR-1.


DYSKUSJA


Średnie przeżycie chorych po nefrektomii z powodu raka nerki przy obecnym rozsianym procesie nowotworowym wynosi tylko 7,5 miesiąca [2, 3]. Rokowanie tych chorych jest zdecydowanie niekorzystne [2, 3]. Obecnie za najważniejszy czynnik rokowniczy choroby uważa się obec- ność lub brak przerzutów nowotworowych [2, 3, 10, 18]. Podkreśla się fakt istnienia mikroprzerzutów u 23 % chorych w momencie diagnozy [2]. Wielkość nowotworu (ocena dokonywana na podstawie klasyfikacji Rob- sona, czy klasyfikacji TNM na podstawie opracowania WHO) oraz sto- pień histologicznej złośliwości pozostają w dodatniej zależności z wystą- pieniem przerzutów [2, 10]. Dlatego wydaje się, że po zabiegu chirur- gicznym poprawę czasu przeżycia chorych można osiągnąć stosując ra- cjonalną chemioterapię, na podstawie dodatkowej analizy czynników modyfikujących efektywność chemioterapii.


Produkt genu MDR-1, transbłonowa P-glikoproteina (Pgp)/ potencjal- nie odpowiedzialna jest za niewrażliwość komórek guza na podawane leki. Analiza immunohistochemiczna Pgp w normalnej tkance nerkowej z użyciem monoklonalnych przeciwciał wykazała, że w największej ilo- ści białko to znajduje się na powierzchni wydzielniczej proksymalnych cewek [15, 20]. Sugeruje to, że produkt genu MDR-1, Pgp odgrywa rolę detoksyfikacyjną, chroniąc komórkę od różnorodnych toksyn [9,15, 20]. Zmienione komórki nabłonkowe cewek proksymalnych, jak zaznaczono wcześniej, są też najczęstszym punktem wyjścia zmian nowotworowych nerek, co może sugerować potencjalnie większy odsetek guzów z ekspre- sją genu MDR-1 [2,10].


W ocenie półilościowej ekspresji mRNA genu MDR-1 wykorzystano zmodyfikowaną metodę opartą na opracowaniu Noonana, 1990 [13].


W metodzie tej wykorzystano mRNA genu ((?2 mikroglobuliny będącego genem referencyjnym. Produkt genu MDR-1 Pgp jest transbłonowym bia- łkiem. Wybór mRNA genu ?2-mikroglobuliny, którego ekspresja jest uza- leżniona od powierzchni błony komórkowej, wydaje się właściwym ukła- dem odniesienia, co podkreślano we wcześniejszych opracowaniach [11, 13]. Dodatkowo w badaniach Noonana, 1990 [13] stwierdzono podobną kinetykę reakcji amplifikacji PCR dla obu genów. Technika ta okazała się również przydatna w ocenie półilościowej poziomu ekspresji mRNA genu MDR-1 w materiale operacyjnym raka nerki u badanych chorych. Swoiste sekwencje cDNA genu MDR-1 były amplifikowane z wykorzystaniem dwóch różnych eksonów, odseparowanych od siebie długim intronem. Taki układ doświadczalny redukował możliwość kontaminacji genomowym DNA przy prepa- rowaniu komórkowego RNA. Dzięki użyciu małego fragmentu 157 par zasad, moż- liwa była ocena obecności swoistego mRNA nawet w materiale, w którym mogły następować procesy degradacji RNA [8, 13, 17].


W badaniach wykorzystujących inne metody biologii molekularnej wy- kazano wyższy odsetek guzów z ekspresją mRNA genu MDR-1, niż w prezentowanym opracowaniu. Goldstein, 1989 [5], w badaniach na li- niach komórkowych raka nerki stwierdził ekspresję mRNA genu MDR-1 w 80% przypadków. W badaniach wykorzystano analizę słot błot i po- równano densytometrycznie autoradiografy nie znanej ilości RNA w ko- mórkach badanych ze znaną ilością RNA (10 (Ig) linii komórkowej KB-8- 5. Komórki tej linii mają zwiększoną ilość mRNA genu MDR-1 bez jego zwielokrotnienia. Podobna metoda była zaprezentowana w pracy Kake- hiego, 1988 [7]. W pracy tej analizowano 14 guzów nerki, wykazując we wszystkich przypadkach ekspresję mRNA genu MDR-1. Dodatkowo w analizie Northern błot wykazano obecność 4,5 kb mRNA, który odpowia- da mRNAP-glikoproteiny. Podobnie jak w naszych badaniach, większość guzów stanowiła typ jasnokomórkowy.


Podobny odsetek obecności produktu genu MDR-1, jak w prezentowa- nym badaniu, był opisany w pracy Naito, 1993 [12]. W pracy tej, w której wykorzystano metody immunohistocherniczne, stwierdzono 52% guzów z obecnością produktu genu MDR-1.


Badania tego typu mogą mieć istotne znaczenie przy zastosowaniu po- tencjalnego leczenia cytotoksycznego u chorych na raka nerki. Analiza poziomu ekspresji genu ma znaczenie przy zaplanowaniu skutecznej che- moterapii z użyciem dodatkowych leków mogących blokować aktywność P-glikoproteiny. Środkiem obecnie stosowanym jest analog varapamilu, dexverapamil [10]. W przypadku zmian nowotworowych opornych na leczenie cytotoksyczne, ale nie mających ekspresji m-RNA genu MDR-1, opracowanie takiego układu pozwoli na badanie innych mechanizmów oporności wielolekowej komórek nowotworowych. Należy podkreślić, że mechanizm oporności guza na leczenie cytotoksyczne jest z reguły wielo- czynnikowy. Niewątpliwie pierwszoplanową rolę odgrywa tu obecność Pgp, a dodatkowymi czynnikami mogą być obecność glutationowej S-trans- ferazy (GST-7T), czy glutationu (GSH) [2, 3, 20], jak również obecność to- poizomerazy-II (Topo-II) [2, 3, 9].


PODSUMOWANIE


W opracowaniu zaprezentowano wykorzystanie metody RT-PCR w ocenie ekspresji mRNA genu MDR-1 u chorych na raka nerki po radykal- nej nefrektomii, u których nie stosowano leczenia chemicznego. Zapre- zentowana prosta i czuła metoda wydaje się obiecującym narzędziem w detekcji ekspresji genu MDR-1, co może mieć potencjalne znaczenie w dalszym racjonalnym użyciu chemioterapii. W ciągu ostatnich 10 lat ana- liza genu MDR-1 w guzach nerek została wyprowadzona z laboratoriów doświadczalnych i staje się powszechnie akceptowaną metodą w klinice, co znalazło odzwierciedlenie w sztandarowym podręczniku urologii, ja- kim jest Campbell?s Urology [2]. Podziękowanie


Autorzy pragną podziękować Panu Mirosławowi Kaczmarskiemu i firmie AGA-PLAST z Olsztynka za pomoc finansową w badaniach.

piśmiennictwo

  1. [1] Dano, K.: Bloch. Actwe Outward Transport of Daunomycin in Resistant Ehrlich
  2. Ascites tumour cells. Biophys. Acta, 1973,323 466-483.
  3. [2] de Kernion, J. B.:Renal Tumors. W WalshP. C. (ed): Campbell's Urology. 5-thed.,
  4. vol. 2. Philadelphia, Pa. Sounders 1986,1294-1342.
  5. [3] DeVita, V. T.: W Cancer: Principles and Practice of Oncology, eds V. T. DeVita,
  6. S. Hellman and S. A. Rosenberg, Lippincrott, Philadelphia 1989, 276-300.
  7. [4] Fojo,A. T, Ueda, K., Slamon, D. J., Poplack, D. G., Gottesman, M.M., Pastan, I.:
  8. Expression of multidrug-resistance gene in human tumours and tissue. Proc. Natl.
  9. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 265-269.
  10. [5] Goldstein, L. ]., Galski, A., Fojo, M.: Expression ofmultidrug resistance gen in
  11. human cancers. J. Natl. Cancer Inst., 1989, 81,116-124.
  12. [6] Hermanek, P, Sobin, L. H. (eds): International Union Against Cancer. TNM Clas-
  13. sification of malignant tumors. Ed 4, Springer-Verlag, Berlin, 1987.
  14. [7] Kakehi, Y, Kanamaru, H., Yoshida, O.: Measurement of multidrug-resistance
  15. mRNA in urogenital cancers; Elevated expression in renal cell carcionoma is associa-
  16. ted with intrinsic drug resistance. J. Urol., 1988,139,862-865.
  17. [8] Kawasaki, E. S.: Amplification of RNA seąuences via complementary DNA (cDNA).
  18. Amplification a formum for PCR Users., 1989,2,4-6.
  19. [9] Mickisch, G., Rohrrich, K., Kossig, J.: Mechanism and modulation ofmultidrug
  20. resistance in primary human renal carcinoma. J. Urol., 1990, 144, 755-759.
  21. [10] Mickisch, G. H., Gaast, A., van der Noordzij, M. A., Scheltema, J. M. W., Stoter,
  22. G., Schroder, F. H.: Dexverapamil to surmount vinblastine ? resistance in renal cell
  23. carcinoma. Cancer Res. Clin. Oncol., 1994,120, Suppl. R8.
  24. [11] Morello, D., Duprey, P, Israel, A., Babinet, C: Immunogenetics. 1985,22,441-452.
  25. [12] Naito, S., Sakamoto, N., Kotoh, S., Goto, K., Matsumoto, T., Kumazawa, J.: Expres-
  26. sion ofP-Glycoprotein and Multidrug Resistance in renal cell carcinoma. Eur. Urol.,
  27. 1993, 24, 156-160.
  28. [13] Noonan, K. E., Beck, C, Holzmayer, T. A., Chin, J. E., Wunder, J. S.: Quantitative
  29. analysis of MDR-1 (multidrug resistance) gene expression in human tumors bypoly-
  30. merase chain reaction. Proc. Nat. Acad. Sci., USA., 1990,87, 7160-7164.
  31. [14] Robson, C, Churchill, B. M., Anderson, W.: The results of radical nephrectomy for
  32. renal cell carcinoma. J. Urol, 1969,101, 297-301.
  33. [15] Rochlitz, C. E, Lobeck, H., Peter, S., Reuter, ].: Multiple drug resistance gene expres-
  34. sion in human renal cell cancer is associated with the histologic subtype. Cancer,
  35. 1992, 69, 2993-2998.
  36. [16] Roninson, I. B., Chin, J. E., Choi, K., Gros, R, Housman, D. E., Fojo, A., Shen, D.
  37. W., Gottesman, M. M., Pastan, I.: Isolation of human mdr DNA seauences amplified
  38. in multidrug-resistant KB carcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1986,83,
  39. 4538-4542.
  40. [17] Sambrok, }., Fritsch, E. E, Maniatis, T.: Molecular Clonning 9. 14-9,19. Cold
  41. Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
  42. [18] Stenzl, A., deKemion, J. B.: Pathology, biology and clinical staging of renal cell
  43. carcinoma. Semin. Oncol., 1989,16, 3-11.
  44. [19] Ueda, K., Cardarelli, C, Gottesman, M. M. and Pastan, L: Expression of full
  45. lenght cDNAfor the human MDR-1 gene confers resistance to colchicine, doxorubicin
  46. andvinblastine. Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 1987, 84, 3004-3008.
  47. [20] Volm, M., Pommerenke, E. W., Efferth, T., Lorkę, H., Mattern, ].: Circum-vention
  48. of multi-drug resistance in human kidney and kidney carcinoma in nitro. Cancer,
  49. 1991, 67, 2484-2489.