Wpływ rubineksu na aktywność fosfatazy zasadowej w nerce szczura
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1983/36/1.

Bauer (wg 8) wykazał, że sproszkowany wyciąg z korzenia marzan­ny barwierskiej powoduje in vitro rozpuszczanie złogów wapniowo-fos-foranowych. W warunkach klinicznych podobne efekty uzyskał Keller (wg 11) podając chorym 6?10 g dziennie sproszkowanego korzenia ma­rzanny. Obecnie preparaty z marzanny barwierskiej znajdują pewne za­stosowanie w leczeniu i zapobieganiu kamicy nerkowej (8). Jest rzeczą oczywistą, że rozpuszczanie kamieni na drodze chemicznej wpływa w istotny sposób na skład jonowy moczu. Zaburzenia proporcji ilościowych pierwiastków mogą znaleźć odbicie w aktywności enzymów biorących u-dział w transporcie przez błony, a w szczególności przez rąbek szczo­teczkowy kanalików nerkowych. Spośród enzymów, które uczestniczą w transporcie, szczególne miejsce zajmuje fosfataza zasadowa. Dzięki wpro­wadzeniu przez Daviesa i Bariera (2) techniki interferometrycznej pow­stały realne możliwości ilościowego określania zawartości tego enzymu w miejscu jego pierwotnej lokalizacji.

Głównym celem podjętych przez nas badań doświadczalnych było ilościowe określenie dynamiki zmian aktywności fosfatazy zasadowej na terenie kanalików krętych nerki w zależności od czasu podawania wy­ciągu z marzanny barwierskiej. Za podjęciem tych badań na zwierzętach zdrowych przemawiał dodatkowo fakt, że fosfataza zasadowa bierze dość istotny udział w procesach transportu wielu substancji i jonów.

MATERIAŁ I METODYKA

W doświadczeniu użyto łącznie 50 białych szczurów Wistar, samców o masie ciała 220?240 g. Zwierzętom przez okres 40 dni, zawsze o tej samej porze, podawano doustnie rubinex ?Herbapol" (Extr. Rubiae tinc. sicc.) jeden raz dziennie w ilości 600 mg/kg. Dawka leku przypadająca na 100 g masy ciała zawarta była w 5 ml wody. Szczurom kontrolnym podawano wodę w ilości 5 ml/100 g. Za kontrolę służyły również te szczury, którym nie podawano badanego leku ani wody. Te zwierzęta uśmiercono w pierwszym i ostatnim dniu doświadczenia. Przez cały czas prowadzonych obserwacji szczury żywiono standardową paszą laboratoryjną, a wodę do picia podawano ad libitum. Wycinki z nerek pobiera­no po 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 i 40-krotnym podaniu, zarówno rubineksu, jak i samej wody, po upływie 4 godzin od podania ostatniej dawki. Bez­pośrednio po uśmierceniu zwierzęcia, materiał zamrażano w temperatu­rze mieszaniny oziębiającej (aceton+suchy lód) i przechowywano w krio-stacie w temperaturze 253K. Bloki tkankowe krojono w kriostacie na skrawki grubości 9 ?m, które następnie przeprowadzano przez kolejne etapy reakcji Gomoriego i Takamatsu do chwili wytrącenia się krysz­tałów fosforanu wapnia. W każdym przypadku czas inkubacji wynosił 90 minut. Ilość wytrąconego produktu reakcji histoenzymatycznej przy­padająca na jednostkę powierzchni (?m2) przeliczano ze wzoru (13):

M ? sucha masa

?? różnica drogi optycznej

? ? swoisty przyrost współczynika załamania ?= 0,0011 (14).

Różnicę drogi optycznej jaką dawały kryształy fosforanu wapnia o-kreślano interferometrycznie stosując technikę dyferenejalną z dużym rozdwojeniem obrazu. W każdym przypadku aktywność fosfatazy zasa--dowej określano w 50 cewkach. Otrzymane wyniki poddano analizie sta­tystycznej, posługując się testem t-Studenta.

Materiał tkankowy utrwalano również w formalinie, wykonując kla­syczne badania histopatologiczne.

WYNIKI

W przypadkach kontrolnych ilość fosforanu wapnia wytrącona w miejscu rąbka szczoteczkowego cewek krętych nerki wynosiła średnio 2,2301 ? 0,0293 X10-12 g/?m2. Zastosowanie rubineksu w dawce 600 mg/kg prowadziło do zmian aktywności fosfatazy zasadowej. W pierwszym okresie obserwacji stwierdzono wyraźny wzrost ilości produktu reakcji histoenzymatycznej. Pięciokrotne podanie badanego leku prowadziło do statystycznie istotnych zmian. Ilość precypitatu przypadająca na jed­nostkę powierzchni wynosiła w tym czasie 2,3348 ?0,0613Xl0-12 g/?m2. Po 10-krotnym podaniu rubineksu ilość fosforanu wapnia określono na 2,3922 ? 0,0441 X10-12 g/?m2. Począwszy od 15 dnia aż do końca spostrze­gania ilość badanego precypitatu malała i wahała się od 2,2030 ?0,0644 X X10-12 g/?m2, w 20 dniu, do 2,1504 ?0,0387 X10-12 g/?m2 w 35 dniu do­świadczenia. W ostatnim dniu badań po 40-krotnym podaniu leku ilość precypitatu fosforanu wapnia określono na 2,1595 ?0,0399 X10-12 g/?m2. Wszystkie otrzymane wyniki różnią się znamiennie statystycznie od war­tości kontrolnych.

Podawanie szczurom wody w ilości 5 ml/100 g masy ciała prowadzi­ło do stopniowego, statystycznie istotnego, spadku aktywności fosfatazy zasadowej. Po 5-krotnym podaniu wody ilość precypitatu określono na 2,2230 ? 0,0284 X10-12 g/?n2. W 10 dniu doświadczenia ilość produktu re­akcji histoenzymatycznej wynosiła 2,2006 ?0,0400 X10-12 g/?m2. W dal­szych dniach prowadzonych obserwacji ilości kryształów fosforanu wapnia malała i wahała się w granicach od 2,1649 ?0,0383 X10-12 g/?m2 do 2,0743 ?0,0526XlO-12 g?m2 po 35-krotnym podaniu wody. W 40 dniu doświadczenia ilość precypilatu określono na 2,0796 ?0,0404X10-12 g/?m2.

Szczegółowe dane przedstawiono na ryc. 1. W tabeli I przedstawiono procentowe zmiany aktywności fosfatazy zasadowej w miejscu rąbka szczoteczkowego cewek krętych po zastosowaniu rubineksu.

Przeprowadzone badania histopatologiczne nie wykazały żadnych od­chyleń od normy w budowie mikroskopowej nerek szczurów użytych w doświadczeniu.

DYSKUSJA

Przegląd piśmiennictwa Pozwala wnosić, że preparaty z marzanny barwierskiej o dużej zawartości frakcji alkoholowej mają pewne zna­czenie lecznicze, a nawet zapobiegawcze. Stosować je można do lecze-nia ataków bólowych nerki i ułatwienia odchodzenia kamieni z układu moczowego. Nikonow (11) w swoich badaniach na temat mechanizmu działania udowodnił, że pod wpływem preparatów z marzanny barwier­skiej dochodzi do obniżenia napięcia mięśni gładkich miedniczki nerko­wej przy równoczesnym nasileniu ruchów perystaltycznych. Na podsta­wie obserwacji chorych z kamicą moczanową, szczawianową, fosforano­wą i mieszaną, ten sam autor ustalił, że po podaniu leku zwiększa się dobowa ilość moczu, wzrasta stopień jego koloidalności oraz ilość wy­dalonego sodu i złogów. Obniżeniu ulega natomiast kwaśność i ciężar właściwy moczu (10).

Do niewątpliwych osiągnięć patologii eksperymentalnej należy fakt wprowadzenia techniki interferometrycznej do pomiarów aktywności fos­fatazy zasadowej. Klasyczna metoda histochemiczna pozwala jedynie na precyzyjne określenie miejsca aktywności enzymu. Zdaniem Deimlinga (3) oceny ilościowej w materiale tkankowym można dokonywać jedynie w tych przypadkach, kiedy wzrost lub spadek aktywności enzymu prze­kracza około 35,0°/o wartości kontrolnych. Dodatkową trudność stwarza fakt, że nie wszystkie reakcje histoenzymatyczne przebiegają stechio-metrycznie. Reakcja na fosfatazę zasadową według Gomoriego i Taka-matsu ma przebieg stechiometryczny tylko do chwili wytrącenia się kry­ształów fosforanu wapnia. W tej postaci produkt reakcji jest niewidocz­ny w zwykłym mikroskopie optycznym; ujawnia się natomiast bardzo wyraźnie w mikroskopie interferencyjnym. Ten szczęśliwy zbieg okolicz­ności umożliwia ściśle ilościowe określenie aktywności fosfatazy zasado­wej na podstawie pomiarów ilości wytrąconego fosforanu wapnia.

Nasze badania przeprowadzone na zwierzętach zdrowych wykazały, że podawanie rubineksu w dawce 600 ?/kg masy ciała powoduje tro­jakiego rodzaju zmiany aktywności fosfatazy zasadowej, w zależności od długości okresu stosowania preparatu (ryc. 1). W pierwszej fazie docho­dzi do szybkiego wzrostu aktywności enzymu z osiągnięciem maksymal­nych wartości około 10 dnia (ponad 7,0% w stosunku do wartości kont­rolnych). Następnie zwraca uwagę równie szybki spadek aktywności aż do 25 dnia doświadczenia (ponad 3,0% w stosunku do normy). W okresie między 25 a 40 dniem daje się zauważyć ustalenie poziomu aktywności fosfatazy zasadowej na poziomie od 3,1% do 3,5% poniżej normy. God­nym uwagi jest fakt, że w ciągu 40-dniowego okresu spostrzegania za­burzeniom enzymu nie towarzyszą żadne uchwytne zmiany morfologicz­ne w obrębie miąższu nerek. W rozważaniach nad mechanizmem bio­logicznego działania rubineksu i interpretacji spostrzeganych zmian hi­stoenzymatycznych z konieczności należy oprzeć się na informacjach uzy­skanych w warunkach klinicznych.

Wiadomo, że podawanie chorym wyciągów z marzanny barwierskiej prowadzi do wyraźnego wzrostu wydalania jonów sodu, potasu i chloru (12). Zaburzenia równowagi elektrolitów wpływają na stan aktywności (Na + K) ATPazy. Z drugiej strony najsilniejsze działanie litolityczne za­wdzięcza rubineks obecności frakcji glikozydów antrachinonowych (15). Pochodne antrachinonów obejmują dużą grupę związków różniącą się między sobą podstawnikami i wykazującą różnorodne działanie biolo­giczne (5, 6, 9). Badania Chingnala (1) udowodniły, że pochodne antra­chinonów mogą działać hamująco na (Na + K) ATPazę błonową, a rów­nocześnie hamują transport jonów sodu. Jeśli działanie takie ma miejs­ce w błonach komórkowych nabłonka kanalików krętych nerek, to ha­mowanie czynności pompy sodowej może stanowić przyczynę zaburzenia równowagi między sodowo-potasowo zależną ATPazą i fosfatazą zasado­wą. Biorąc pod uwagę fakt ścisłej korelacji obu enzymów (4) należy są­dzić, że wzrost aktywności fosfatazy zasadowej w pierwszym okresie stosowania rubineksu jest przejawem mechanizmów adaptacyjnych, po­legających na przejmowaniu przez fosfatazę zasadową czynności trans­portowych błony cytoplazmatycznej w miejscu rąbka szczoteczkowego.

Na osobne omówienie zasługuje spadek aktywności fosfatazy zasado­wej występujący po dłuższym stosowaniu leku. Wydaje się, że zjawisko to może być następstwem szczególnie intensywnego wychwytywania ant-rachinonów przez nerki (11). Fakt ten może prowadzić do zaburzeń czyn­nościowych narządu, a między innymi do obniżania się aktywności wie­lu enzymów w tym również fosfatazy zasadowej. W trzecim etapie, wy­stępująca pod wpływem rubineksu ucieczka jonów może sprzyjać uru­chomieniu przez ustrój mechanizmów regulacyjnych, mających na celu przywrócenie izowolemii, izojonii, izobarii oraz prawidłowego ciśnienia perfuzyjnego w nerkach. Wyrazem tej adaptacji jest ustalenie się ak­tywności fosfatazy zasadowej na jednakowym mniej więcej poziomie, poniżej wartości kontrolnych. .

Podobne mechanizmy mogą brać udział w spadku aktywności fosfa­tazy zasadowej występującym pod wpływem przeciążenia wodnego. Za­gadnienie to wymaga jednak przeprowadzenia osobnych badań doświad­czalnych i będzie tematem następnego doniesienia.

1. Chignal C. F.: The effect of phenolphitalain and other pumgative "drug on rat intestinal (Na + K) Adenosine , triphosphatase. Biochem. Pharmacol., 1968, 17, 1207.
2. Davies H. G., Barter R., Danielli J. F.: A ąuantitathre method far enizy-me cytochemisitiry applied to alkaline phosphatase. Nature, 1954, 173, 11234.
3. Deimling V. O., Nemitz H.: Honmoinabhanigige Enizymverteiliung in Geweben. X. Die óstradiolabhainigige Activitatssteigerung der alkalischen Nierenphosphatase von Rat-Hiistochemie, 1967, 11, 360.
4. Fischman W. H.: Ferspeetives on alkaline phosphataise isoemzyimes. Am. J. Med., 1974, 56, 617.
5. Garcia-Yillar R., Leng--Peschlow E., Ruckenbusch Y.: Effect of anthtraą-udnane deriwatiyes on oanine a,nd rat ir.testinal. motility. J. Pharm. Pharmacol., 1980, 32, 323.
6. Hilgert J., Cud-lin N. S., Steinerovd N., Vanekz Z.: Antitumour and immunosupersiye activity of hydroxyanthraquinones and their derivatives. Folia Biol., 1977, 23, 99.
7. Jar-gensen P. L.: Energetic of active transtubular transport function of the Na-K-ion. pump. Europ. J. Biochem., 1980, 12, 283.
8. Kollwitz A. A.: Mediikamentose Be-einflussu:ig der Hamsiteine. W: Der Harnstein, Hienzsch E., Schneider H. J., Gustav Fischer, Jena, 1973, 197.
9. Leng-Peschlow E.: Iohibition of intestinal wa-ter and electrolyte atasorption by senna denivatives in rats. J. Bhanm. Bharmacol., 1980, 32, 330.
10. Modliński L.: Badania nad wpływem niektórych leków na kamicę narządu moczowego. Biul. Cefianm, 1972, XXIII, 3, 93.
11. Nikonow G. K.: Dry extract of Rubia tinctorum. Aptecznoje Dieło, 1962, 11, 31.
12. Ożarowski A., Łańcucki J.., Gąsiorowska K.: Leki Roślinne. Herbapol, Warszawa, 1978, 304.
13. Pluta M.: On the rmctrointerferametric determination of the dry mass of non-plate cells. Folia Histochem. Cytochem., 1967, 5, 4, 409,
14. Ross K. F. A.: Phase constrat and interferenice mioroscopy for cell biodogdsts. Edward Arnold, London, 1967, 234.
15. Wrociński T.: Badania farmakologiczne preparatów Rubia tiinotoiiiuim ze szczególnym uwizględmieniam działania przeciwka-micowego. Herba Bolooksa, I1S73, 19, 262.